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负载地塞米松的间充质干细胞外泌体的构建及其抗自身免疫性肝炎的作用

赵佳伟  
【摘要】:目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一种由未知病因引起的免疫介导的炎症性疾病。目前临床治疗仍然以对症支持治疗为主,酌情使用激素,后期考虑肝脏移植治疗。前者副作用明显,后者供体时而受到限制。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)来源的外泌体(exosome,Exo)含有丰富的生物活性物质,具有修复特定损伤细胞和组织的巨大潜力,可用于AIH的治疗。本研究旨在利用间充质干细胞分泌的外泌体设计药物传递系统,用于装载激素药物地塞米松(Dexamethasone,DEX),进而被装载到外泌体中,即构建装载有地塞米松的间充质干细胞外泌体Exo@DEX。同时,在细胞和动物实验两方面,观察Exo@DEX的细胞表型特性、Exo@DEX肝脏靶向性,以及Exo@DEX对自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)的治疗作用与安全性评价。方法:(1)利用全骨髓法提取小鼠骨髓间充质干细胞,培养至第3代后使用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对细胞进行表面蛋白鉴定。收集细胞上清,利用超速离心法分离提纯Exo,利用脉冲式超声法将小分子药物DEX装载入Exo中,构建出载药外泌体Exo@DEX。利用Western Blot鉴定Exo和Exo@DEX表面的外泌体标志蛋白CD9和CD63,生物透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察Exo和Exo@DEX的形貌,纳米颗粒追踪和动态光散射分析Exo和Exo@DEX的粒径和电位,高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法检测Exo@DEX中DEX的含量。(2)在细胞水平,利用CCK-8法检测Exo@DEX对RAW264.7与L02细胞活性的影响;利用凋亡试剂盒检测Exo@DEX对细胞凋亡的影响;利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪在不同时间点检测细胞对Exo@DEX的摄取情况。(3)在动物水平,利用小动物成像系统考察Exo与Exo@DEX对肝脏的靶向功能、在各脏器的分布以及在肝脏中的滞留时间,利用流式细胞术和冰冻切片验证Exo与Exo@DEX在肝脏中的富集;利用刀豆蛋白A构建小鼠自身免疫性肝炎模型,8 h后获取小鼠血清检测转氨酶水平,取肝脏组织制备HE切片,并获得肝脏组织研磨液进行炎症因子的检测;健康小鼠给予Exo@DEX,获取各组织器官HE切片,进行血常规和血生化分析,考察药物的生物安全性。结果:(1)原代培养的间充质干细胞纯度大于95%;Exo和Exo@DEX均表达CD9和CD63,透射电镜均呈现为类圆形的囊泡样结构,粒径分布在100 nm左右,Exo的电位约为-10 mV,Exo@DEX的电位约为-6 mV;高效液相色谱检测到DEX的特征峰。(2)与DEX组相比,Exo@DEX降低了巨噬细胞的活性,促进其凋亡的发生,而对L02细胞没有明显影响;将Exo@DEX与细胞共孵育后,RAW264.7与L02细胞均能够摄取纳米颗粒,呈现时间依赖性,且RAW264.7摄取更多的纳米颗粒。(3)Exo和Exo@DEX均能够靶向肝脏,在2 h即可达到高峰,且能够滞留24 h,装载药物对外泌体的脏器分布和滞留时间没有明显影响;在AIH模型中,Exo@DEX能够有效减小肝脏的损伤,降低肝脏转氨酶和炎症因子水平;在药物安全性实验中,Exo@DEX对各组织器官没有明显毒性,血常规和血生化指标没有发生明显改变。结论:(1)成功构建了负载地塞米松的间充质干细胞外泌体Exo@DEX(2)初步获得了Exo@DEX治疗自身免疫性肝炎的治疗效果(3)研发了一种具有生物安全性的肝脏靶向的药物递送体系


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