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白蚁肠道产氢微生物的筛选和氢化酶异源表达及特性研究

傅毓  
【摘要】:可再生绿色新能源领域的研究是解决当前环境污染与能源短缺这两大世界难题的有效途径之一。氢能作为一种高效的清洁能源,近年来一直被视为具有发展前景的新能源,受到了世界各国的广泛关注与重视。生物制氢技术主要指微生物在生长代谢过程中通过分解各种有机物产生氢气。与传统的物理化学制氢技术相比,生物制氢技术具有绿色环保和可循环利用等优点。其中微生物发酵制氢技术由于操作简单和原料来源广泛等优点逐渐成为生物制氢技术研究的热点领域之一。微生物发酵制氢技术可以从高效产氢微生物的筛选以及构建新的产氢代谢途径等方面进行研究。白蚁具有高效降解和转化木质纤维素的能力,其特殊的肠道微生物群落引起了研究者的关注,本研究从白蚁肠道中分离筛选并鉴定产氢菌株、微生物发酵产氢条件的优化以及产氢过程关键酶的异源表达这三个方面进行了探索和研究。本文的主要研究内容和研究结果如下:(1)通过白蚁肠道微环境中分离筛选并鉴定产氢菌株双酶梭状芽孢杆菌(Clostridium bifermentans G3)的基础上,对其发酵产氢特性进行研究。通过16S rDNA序列分析鉴定该菌为梭菌属,与双酶梭状芽胞杆菌(Clostridium bifermentans strain W11109B1-1)的相似度达到99.78%。菌株G3发酵产氢的最适温度为30℃,最适pH为6.9,产氢量达到1.3 mol H_2/mol Glucose。(2)选用不同来源的产氢微生物为研究对象,采用重组表达技术分析了不同来源的氢化酶在大肠杆菌中异源表达效果。通过GeneBank数据库分析发现双酶梭状芽孢杆菌(C.bifermentans)来源的氢化酶为单亚基[FeFe]氢化酶,采用PCR扩增技术扩增单亚基[FeFe]氢化酶基因并连接到大肠杆菌表达载体中进行异源表达;同时对嗜热菌新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)来源的三个亚基组成的[FeFe]氢化酶采用多顺反子(Polycistron)串联表达和各个亚基单独表达的策略在大肠杆菌中进行了异源表达。双酶梭状芽孢杆菌(C.bifermentans G3)来源的氢化酶表达量低,而新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana DSM 4359)来源的[FeFe]氢化酶在大肠杆菌中表达时出现不溶性包涵体。(3)对新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana DSM 4359)产氢途径关键酶:丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(PFOR)和铁氧还蛋白(Fd)进行表达和纯化,并对PFOR酶的酶学特性进行了分析。PFOR酶最适反应温度为90℃,最适反应pH为11,在有氧环境中易失活。本文通过筛选鉴定产氢菌株并分析其产氢途径关键酶的功能特性,为菌株优化和改造提供理论依据。


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