MAPK信号通路在β-葡聚糖刺激巨噬细胞生成NO和TNF-α中的作用

【摘要】： β-葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖,同时也是真菌细胞壁结构中最稳定的部分,可以引发吞噬细胞的吞噬、释放细胞因子等一系列天然免疫反应。作为细胞壁的多糖成分,有多种生物学活性和免疫药理学作用,已成为众多领域的研究热点。整体动物试验研究表明,β-葡聚糖具有免疫调节作用,可以促进动物体内免疫功能细胞分泌各种免疫活性因子,然后通过这些因子的介导,使整个免疫系统功能增强。 巨噬细胞在免疫系统中具有十分重要的地位,它通过吞噬、提呈抗原、激活淋巴细胞、分泌和产生细胞因子、活性氧及NO等行使抗感染、抗肿瘤等生理功能,是机体免疫应答、免疫调节中的重要环节。明确β-葡聚糖对巨噬细胞免疫功能的影响及其作用机理,对于阐明β-葡聚糖的免疫调节功能及其作用机制具有重要意义。 目前国内关于β-葡聚糖免疫调节功能方面的研究不多,研究方法多以整体动物实验为主,大多停留于蛋白质水平,对于上游水平的研究非常少。本课题以小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象,运用细胞生物学技术,采用中性红比色法检测β-葡聚糖对巨噬细胞的增殖作用。用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术,检测β-葡聚糖作用于巨噬细胞后对其产生NO和TNF-α的影响,并初步讨论了MAPK通路在这一过程中的作用。用Western blot法检测细胞内MAPK信号通路的活化情况。 实验结果显示β-葡聚糖对巨噬细胞的增殖和吞噬作用均呈双相性。低浓度β-葡聚糖对RAW264.7细胞具有促进作用,随着β-葡聚糖浓度的逐渐增大,A值也不断升高,至β-葡聚糖浓度100μg/ml时达最高峰,同时可明显提升其吞噬能力。但随着β-葡聚糖浓度进一步增高,A值反而下降,当浓度为400μg/ml时几乎完全抑制细胞的增殖作用;受β-葡聚糖刺激6小时后RAW264.7细胞开始分泌TNF-α和NO,并随着刺激时间的增长,分泌量在不断的增加,在24小时时达到高峰,随着时间的推移,细胞因子的表达量也有所增加,但是增加量在逐渐减少。ERK1/2通路的抑制剂(PD98059)试验结果显示其可抑制受刺激RAW264.7细胞释放TNF-α和NO。Western blot结果显示,β-葡聚糖作用于小鼠巨噬细胞后,细胞内MAPK通路ERK1/2和ERK5发生酪氨酸磷酸化,都参与到细胞内的信号传导中。 以上结果显示:β-葡聚糖对小鼠巨噬细胞的增殖和吞噬的作用均呈双相性;100μg/ml的β-葡聚糖激活巨噬细胞释放NO和TNF-α的活性较强;β-葡聚糖使胞内MAPK信号通路中的ERK5和ERK1/2发生酪氨酸磷酸化;ERK1/2通路不是β-葡聚糖诱导巨噬细胞生成TNF-α和NO的主要通路。这是β-葡聚糖在体外引起巨噬细胞免疫活性增强的重要细胞内信号传导机制之一。