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家蚕浓核病毒BmDNV-3基因组结构与功能的研究

王永杰  
【摘要】: 浓核病毒无囊膜,直径18~26nm,基因组大小约为4.0~6.5kb。该病毒内含有正负链单分子(ssDNA),或为正链,或为互补的负链。浓核病毒具有高度的宿主特异性,并且在通常情况下能引起宿主的死亡。目前浓核病毒最为关注的是可作为生物杀虫剂和表达载体表达外源蛋白。家蚕作为经济昆虫的重要性,自上世纪80年代人们先后从日本(BmDNV-1、BmDNV-2、BmDNV-5)、中国镇江(BmDNV-3)和印度(BmDNV-4)的家蚕中分离到了不同株系DNVs。其中BmDNV-3和BmDNV-2(Yamanashi isolate)都拥有双分子基因组(VD1,VD2),并且感染相同的宿主,但在感受性、血清学上有差异,在宿主感染部位上也存在着不同。本论文中以BmDNV-3作为研究对象,对其基因组的结构和功能进行研究。主要结果如下: 1.浓核病毒BmDNV-3基因组中含有两种没有同源性的单链线形DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链(+VD1,-VD1;+VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中。该病毒DNAs在高盐状态下被分离、纯化。用T4酶(300ngDNA/10U)补平抽提过程中复性为双链的病毒DNAs,然后用HindⅢ进行酶切,酶切后的片段克隆到经过HindⅢ和SmaⅠ平端酶切的pUC119载体上,完成了对该病毒的全基因组克隆和序列测定。序列装配的结果显示:VD1全基因组序列长为6543个核苷酸,末端拥有224个核苷酸末端反向重复序列;VD2全基因组序列长为6022个核苷酸,末端拥有524个核苷酸末端反向重复序列。GenBank序列登录号:[DQ017268;DQ017269]。 2.生物信息学分析显示:VD1基因组正链含有3个大的开放阅读框(ORF1~3),ORF1和ORF2可能编码非结构蛋白,因为它们含有细小病毒保守区域序列NTP-binding和DNA解旋酶结合域,而ORF3可能编码结构蛋白,负链含有1个大的开放阅读框(ORF4),由于它与假定的DNA聚合酶有一定的同源性,因此推测可能编码非结构蛋白。对VD1 ORF4的1115氨基酸序列与其它病毒DNA聚合酶基因氨基酸序列比对,发现N端含有3个外切酶的保守区域与原核和真核生物3′→5′外切酶相关,5个保守区域涉及到DNA聚合酶的合成功能,这8个保守区域显示VD1 ORF4编码DNA聚合酶;VD2基因组正链含有1个大的开放阅读框,负链含有1个小的开放阅读框。根据同源性比较推测该基因组负链上开放阅读框(ORF2)可能编码非结构蛋白,而正链上开放阅读框(ORF1)可能编码病毒的结构蛋白。 3.比较BmDNV-3和BmDNV-2(Yamanashi isolate)基因组全序列,两者VD1的同源性为98.4%,VD2同源性达97.7%,并且有228个碱基的替代、11个碱基的删除和2个碱基插入。比较这两个不同株系病毒的开放阅读框和末端反向重复序列,突变的热点集中在结构蛋白(VD1 ORF3,VD2 ORF1),VD1 ORF4和末端反向重复序列上。本研究中的结论为更好地理解家蚕浓核病毒不同株系差异性及其可能的原因,也为研究家蚕浓核病毒进化提供了有益的线索。 4.在对VD1基因转录组织结构研究中,Northern杂交显示VD1的左边正链上有1.1kb非结构蛋白和1.5kb结构蛋白这两个转录本,右边的负链上有一个3.3kb非结构蛋白转录本。3′和5′RACE序列测定结果显示1.1kb非结构蛋白开始于nt290,结束于nt 1437。ORF1和ORF2完全位于其中,因此有可能通过核糖体扫描机制在不同的阅读框上翻译两种蛋白NS1和NS2。1.5kb结构蛋白开始于nt 1423,结束于nt 2931。编码结构蛋白的转录本(ORF3)和编码非结构蛋白的转录本(ORF4)在图距50处拥有10个核苷酸的3′端的共同序列。该病毒的转录方式与已报道的其它浓核病毒存在着较大差异。 5.该病毒感染的家蚕中肠组织经匀浆、40%(W/W)CsCl_2梯度离心和定量PCR,结果显示VD1和VD2两者的浮力密度接近相等,约为1.29 g/cm~3。该病毒的浮力密度比其它浓核病毒明显小,再次说明该浓核病毒的特殊性。从不同梯度等份样品中VD1、VD2的起始拷贝数判断,得出它们可能位于各自不同的病毒衣壳蛋白中。另外,SDS-PAGE电泳分析结果显示BmDNV-3病毒的衣壳蛋白的分子量为48kDa、55kDa、72kDa和97kDa的4条明显条带,其中53kDa为主要组分。 6.在原核表达载体中构建了pET28a(+)-VD1 ORF4 3′端部分,然后转化到大肠杆菌BL21中。通过IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示在62 kDa左右有一特异条带,与预测的蛋白质分子量大小一致。另外,还在杆状病毒表达系统中,构建了重组转座载体pF_(AST)B_(AC)HTB-VD1 ORF4 3′端部分。


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1 肖杰;家蚕浓核病毒(BmDNV-1)结构蛋白基因的表达及其启动子活性的初步研究[D];华中师范大学;2011年
2 江军;家蚕浓核病毒BmDNV-1荧光假病毒粒子的制备及人博卡病毒VP2的纯化[D];华中师范大学;2012年
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