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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm61、orf74的基因分析

申红星  
【摘要】: 杆状病毒是节肢动物特别是鳞翅目昆虫重要的病原微生物。到目前为止,已有47种杆状病毒完成了全基因组测序。序列分析发现,仅有30个基因在所有已经测序的杆状病毒中都存在,称为核心基因。在鳞翅目昆虫杆状病毒中,有62个基因是保守的。 本研究以家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)核心基因Bm61和非核心基因orf74为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位、基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能,从而为丰富杆状病毒分子生物学提供理论基础。论文主要结论如下: 1.BmNPV的orf61(Bm61)位于基因组61,188—61,892 nt,全长399bp,编码一个含133个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为15.5 kDa,Bm61是AcMNPV orf75的同源序列。在Bm61基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA。 2.RT-PCR分析发现,Bm61在病毒感染宿主细胞12h开始转录,直到72h。利用大肠杆菌表达系统表达了BM61融合蛋白并制备了多克隆抗体。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm61的表达产物在病毒感染宿主细胞后12 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为15.5kDa,与预测的大小一致,说明Bm61是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。利用抗体检测发现BM61定位在细胞核膜和细胞核内周。 3.利用phageλRed重组酶和Bac-to-Bac系统,在家蚕核型多角体病毒Bacmid中成功敲除Bm61基因。缺失Bm61的Bacmid转染细胞后,只有少量的细胞荧光,说明缺失Bm61导致病毒在细胞间的传染出现异常。PCR显示转染细胞的上清中没有BV产生,而Bm61的拯救病毒表现出和野生病毒相同的特性。证明Bm61是BV产生的必需基因。进一步分析Bm61缺失不影响病毒基因组复制和gp64的转录。 4.orf74位于BmNPV基因组的69,987-70,449 nt之间,全长462 bp,编码154个氨基酸残基,预测分子量大约为17.3 kDa。在orf74基因ATG上游9nt处有一个杆状病毒晚期转录基序TTAAG。orf74是AcMNPVorf91的同源序列, 5.orf74的转录分析表明,orf74从病毒感染后12h开始转录,一直持续到96h,可能是一个晚期表达基因。利用ORF74与GFP融合对其亚细胞定位进行了观察,发现ORF74的表达集中在细胞核。 6.敲除orf74基因后构建了缺失orf74的病毒vBm-ko。vBm-ko在BmN上的复制结果表明:orf74的敲除不影响病毒在BmN细胞上增殖和基因组复制。幼虫分析表明orf74的敲除可以延长病毒杀死幼虫的时间,但是病毒的产量没有明显差异。这些结果表明orf74可能是病毒复制的非必须基因,可能与病毒的毒力有关。


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