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家蚕对细小病毒样病毒(中国株)非敏感性因子的初步研究

李晓刚  
【摘要】: 家蚕细小病毒样病毒(B.mori Parvo-like Virus,BmPLV),过去称为家蚕浓核病毒Ⅱ型,是夏秋季养蚕中常见的软化病病原,也是蚕业上危害较大的病毒之一。细小病毒样病毒已知毒株有日本的山梨株和中国镇江株(BmPLV-Z)。有部分家蚕品种对此病毒表现完全不感染,这种抵抗性分别由两个隐性单基因(山梨株nsd-2;镇江株nsd-Z)控制。形态遗传学研究表明:nsd-2位于第17连锁群,nsd-Z位于第15连锁群。对家蚕抵抗细小病毒样病毒机制目前尚不清楚。 2008年,Kidokoro等依据抗性分子标记,利用染色体步移法克隆了家蚕细小病毒样病毒山梨株的非敏感性基因nsd-2。该突变基因是由其野生型+~(nsd-2)基因的部分缺失造成。敏感性基因+~(nsd-2)是一个由十四个外显子组成的基因,编码一个十二次跨膜蛋白,属于氨基酸转运蛋白家族成员之一。研究者通过转基因的方法,证实+~(nsd-2)基因可以介导病毒的感染。细小病毒样病毒镇江株在血清学和基因组结构上与山梨株具有很高的一致性。我们推测对镇江株抗性或感性的家蚕品系中也存在有nsd-2和+~(nsd-2)基因的同源基因nsd-2'和+~(nsd-2'),并且参与介导镇江株的感染。 本研究主要通过PCR扩增和RT-PCR鉴定了对家蚕细小病毒样病毒中国镇江株抗性/感性宿主的nsd-2'和+~(nsd-2')基因及其在宿主组织内表达。从基因组DNA和mRNA水平上分析nsd-2'和+~(nsd-2')基因。对非敏感性nsd-2基因进行原核表达,对敏感性+~(nsd-2)基因进行杆状病毒表达。 1.对BmPLV-Z不同敏感性家蚕的nsd-2和+~(nsd-2)的同源基因鉴定 参照+~(nsd-2)基因序列,设计覆盖基因不同区域的三对引物D1、D2、D3,在对BmPLV-Z抗感性不同的家蚕品种基因组PCR分析,结果显示,三对引物在对BmPLV-Z敏感性不同的家蚕品系中获得的片段皆小于BmDNV-2中约300 bp,由三对引物的覆盖范围来看,推测在对BmPLV-Z敏感性不同的家蚕品种中,第13个内含子缺失约300 bp的碱基。对BmPLV-Z抗感性不同的家蚕品种mRNA的RT-PCR分析,扩增产物显示nsd-2'和+~(nsd-2')在mRNA水平上与nsd-2和+~(nsd-2)大小一致。 通过RT-PCR分析了在敏感性家蚕的不同发育阶段和不同组织中+~(nsd-2)基因的转录情况,结果表明,+~(nsd-2)基因在家蚕一龄到五龄阶段都有表达;而在组织分布上,该基因只在中肠组织中表达。 2.nsd-2和+~(nsd-2)同源基因的克隆和功能域分析 对nsd-2'和+~(nsd-2')基因编码区克隆和测序。结果显示,nsd-2'和+~(nsd-2')基因编码区的碱基序列与山梨株的nsd-2和+~(nsd-2)完全一致。暗示两病毒具有相同的病毒入侵抵抗机制。功能域分析显示,+~(nsd-2)基因表达一个11次跨膜蛋白,且分别在155、178、520存在三个糖基化位点。通过家蚕基因组数据库染色体定位显示,该基因位于第11号染色体上。 3.非敏感性基因nsd-2的原核表达 将家蚕非敏感性基因nsd-2编码区序列,克隆到带有His标签的原核表达载体pET-30a上,利用大肠杆菌Rosetta株系进行表达,得到了分子量约27 kDa的融合蛋白,融合蛋白分子量大小与预期相符。Western blot分析表明所获融合蛋白就是所要表达的目的蛋白,目的蛋白的表达量较低。 4.敏感性基因+~(nsd-2)的真核表达 敏感性基因+~(nsd-2)编码区序列克隆到转移质粒pFasBacHTb,并与AcBacmid重组。应用脂质体将重组杆粒AcBacmid-+~(nsd-2)转染Sf9细胞,产生重组病毒。将获得的重组病毒重复感染Sf9细胞表达目的蛋白。经Western Blot检测获得的蛋白为完整表达的+~(nsd-2)蛋白,但是目的蛋白的表达量不高。


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