家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂（Bmserpin-2）和类成虫盘生长因子（BmIDGF）的亚细胞定位及组织表达分析

【摘要】： 家蚕是重要的经济昆虫,蚕丝业是我国拥有5000多年历史的传统产业,在社会经济文化生活中占有重要地位,同时家蚕也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕功能基因组学的研究将为全面、准确的了解家蚕生物性状的遗传基础和分子调控机制,为改善蚕丝质量提供理论基础,也为揭示基础生物学现象奠定了基础。 本论文课题通过实验和生物信息学相结合的方法克隆得到了家蚕二个基因,并对这些基因做了初步的结构和功能分析。主要研究结论如下: (1)从Genbank中搜索到家蚕Bmserpin-2基因(GenBank登录号:AF242200),并运用相关的生物信息学软件对其进行分析,表明家蚕Bmserpin-2基因编码374个氨基酸,具有保守的SERPIN结构域,在进化上与其它无脊椎动物的serpin-2具有高度同源性。RT-PCR结果显示该基因在家蚕卵巢、精巢、脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、血淋巴,以及蚕卵、一龄到五龄的家蚕中都有表达。利用荧光定量PCR分析在感染家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后不同时间段该基因在中肠表达情况,结果表明:抗性家蚕品系(NB)在感染BmNPV后,各时间段Bmserpin-2的表达量无显著性差异。感性家蚕品系(306)在感染BmNPV 72h后,Bmserpin-2的表达量显著提高,表明Bmserpin-2可能参与了家蚕免疫。 利用pET-30a表达系统,在大肠杆菌中表达该基因,运用质谱技术对其进行鉴定,并纯化蛋白制备抗体。通过细胞免疫组化实验发现该基因定位于整个细胞中。 (2)从Genbank中搜索到家蚕IDGF基因(GenBank登录号:AB183872),即BmIDGF,并运用相关的生物信息学软件对其进行了分析,表明BmIDGF基因编码434个氨基酸,具有保守的glycosylhydrolases family 18结构域。BmIDGF属于几丁质酶18家族中的GroupⅤ,在进化上与其它无脊椎动物的IDGF蛋白具有高度同源性。RT-PCR结果显示该基因在家蚕卵巢、精巢、脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、血淋巴中,家蚕蚕卵的各个发育时期,以及一龄到五龄的家蚕中都有表达,Western blot的结果也进一步验证了该基因在家蚕血淋巴、中肠、卵巢、丝腺和脂肪体中的表达。利用pET-30a表达系统,在大肠杆菌中表达了该基因,运用质谱技术对其进行了鉴定,并纯化蛋白制备了抗体。通过细胞免疫组化实验发现该基因编码的蛋白可能为分泌型蛋白。