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Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

谢新民  
【摘要】: 目的: Hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌Hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。 方法: 1.伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备。用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq向基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,并在引物5'-末端加上需要的酶切位点,扩增hfq向基因上、下游同源性片段,定向连接成hfq基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后,克隆至大肠埃希菌中,筛选阳性克隆,并对重组质粒进行测序鉴定,将阳性重质粒经电击法导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 2.全基因组芯片分析伤寒沙门菌转录表达谱。利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/LNaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株4h(37℃,250 rpm)至对数生长期,然后加入NaCl达到终浓度300 mmol/L(高渗),继续培养30 min后,分别提取野生株和hfq基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。 3.在伤寒沙门菌hfq缺陷变异株中回补hfq基因。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,用PCR扩增含启动子区域hfq基因,并将其与pBAD/gⅢ质粒定向连接,筛选重组质粒并进行测序鉴定,将阳性重组质粒经热击法导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株,作为hfq基因回补株,同时用pBAD空质粒导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株作为对照株。 4.hfq-ompR双缺陷菌株变异株制备。将含hfq基因同源缺失片段的阳性重组自杀质粒pGMB151用电击法导入ompR缺陷菌株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq-ompR双缺陷菌株。 5.qRT-PCR分析基因表达。选择部分芯片分析显示表达差异基因,设计并合成特异性引物,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),验证芯片分析结果;设计tviA基因特异性引物,qRT-PCR分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株和hfq基因回补菌株分别在持续低渗、持续高渗和高渗应激环境中tviA的表达,以探查不同环境下hfq对tviA的调节作用;并进一步分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株、ompR基因缺陷变异菌株和hfq-ompR双缺陷菌株在高渗应激下的tviA表达的变化,察看Hfq和OmpR对tviA的调节是否存在联系。 结果: 1.PCR及序列分析证实,hfq基因缺陷变异株中hfq基因缺失了132bp,表明成功构建hfq基因缺陷变异株。 2.基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。这些基因主要涉及侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类和一些未知功能的推测蛋白。部分差异表达基因经qRT-PCR验证,结果显示与基因芯片表达谱分析结果一致。 3.PCR及序列分析证实hfq基因回补菌株及hfq-ompR双缺陷菌株制备成功。 4.在高渗应激下hfq基因缺陷变异株中tviA表达上调,hfq基因回补菌株tviA表达与野生株接近,而在持续低渗和高渗条件下野生株和hfq基因缺陷变异株中tviA的表达水平相似。在高渗应激下hfq-ompR双缺陷菌株中的tviA的表达水平与hfq基因缺陷变异株中的基本一致。 结论: Hfq在伤寒沙门菌高渗应激条件下对基因表达调节及侵袭力的提高等发挥重要作用;伤寒沙门菌在高渗应激后Hfq能抑制tviA基因的表达,而在稳态高渗下没有作用;伤寒沙门菌Hfq在高渗应激下对tviA的调节与OmpR无直接相关。


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