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骨髓瘤细胞和骨髓间充质干细胞(BMMSCs)相互作用过程中对BMMSCs生物学特性影响的实验研究

张广莲  
【摘要】: 目的:研究多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞与人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在体外共培养过程中,诱导BMMSCs成骨的情况以及相关基因DKK1 Decorin、Collagen1、Smad5的表达情况。探讨体外骨髓瘤细胞能否诱导正常的BMMSC出现类似骨髓瘤病人BMMSC异常,为进一步阐明MM发病机制、探索MM新的临床治疗靶点提供理论和实验基础。 方法:1、以分离和培养的正常第3代BMMSCs作为研究对象。实验分为2组:①以BMMSCs单独培养第5、8、12天组为对照组;②以与U266细胞共培养第5、8、12天三个时间点的BMMSCs作为实验组。2、与U266细胞共培养的BMMSCs细胞,分别于第5、8、12天倒置显微镜下检测生长状况、形态和细胞数目,比较实验组与对照组BMMSCs细胞增殖能力的变化情况。3、分别在BMMSCs单独培养及与U266细胞共培养五天后加入用含地塞米松(10-~8 mol/L)、维生素C(0.05g/L)和β-甘油磷酸钠(10~(-2)mol/L)的L-DMEM成骨条件培养液,诱导BMMSCs向成骨细胞(Osteoblasts,OB)分化,于诱导第14天,取BMMSCs分别进行碱性磷酸酶(ALP)和AlizarinRed染色以检测BMMSCs的OB形成能力。4、在对照组BMMSCs及实验组BMMSCs第5、8、12天终止培养,提取总RNA,Real-TimePCR法测定BMMSCs中DKK1、Decorin、Collagen 1、Smad5 mRNA表达水平,并进行统计学分析。 结果: 1.倒置显微镜下观察,实验组及对照组BMMSCs形态均以长梭形为主,呈贴壁生长,对照组及实验组BMMSCs一般形态无显著差异。在共培养的过程中,BMMSCs的增殖能力无显著变化。 2.成骨诱导后的第14天,检测BMMSCs成骨能力,经Alizarin Red染色及ALP染色后结果显示:实验组与对照组BMMSCs均可在成骨诱导培养过程中向成骨细胞分化,但与U266细胞共培养来源的BMMSCs成骨分化潜能较差,矿化基质沉积减少。 3.Realtime-PCR结果显示:同对照相比,与U266细胞共培养的BMMSCs细胞,其Collagen1、Decorin、DKK1和Smad5的基因表达有显著的变化。(1)Collagenl基因在对照组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为50.2382±16.1061、42.2650±9.5823和57.9167±17.0791.实验组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为19.8600±6.8429、20.8633±7.6858和15.8267±6.3454,且与对照组比较均显著降低(P均0.05);(2)Decorin基因在对照组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为14.8414±3.0398、15.6800±3.0845和12.9086±2.6157,实验组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为4.6657±0.9456、5.9857±0.9894和5.5714±0.9292,与对照组比较均显著降低(P均0.05);(3)Smad5基因在对照组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为5.2725±1.5321、11.5275±2.6250和7.2125±2.0749,实验组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为2.7125±1.4307、1.7125±0.2288和2.8325±0.8263;实验组第5、8、12天基因表达水平较对照组显著降低(P0.05)。(4)DKK1基因在对照组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为2.4757±0.6017、8.8821±2.0199和3.5250±2.7964,实验组第5、8、12天表达的相对拷贝数均值分别为6.4537±1.3495、12.8947±7.9996和3.7819±1.3803;实验组5天较对照组显著升高(P0.05),第8、12天DKK1基因表达水平较对照组增高但无统计学意义(P0.05)。 结论: 1.与U266细胞共培养的BMMSCs细胞,在5、8、12天内形态无显著变化。 2.与U266细胞共培养的BMMSCs细胞增殖能力较对照组无显著变化,但其成骨细胞分化形成能力下降。 3.与U226细胞共培养后,BMMSCs细胞群体的DKK1基因表达水平上调,Collagenl、Decorin、Smad5基因表达下调,表明在骨髓瘤疾病中骨髓瘤细胞有可能调节BMMSCs成骨相关基因表达水,使BMMSCs成骨能力下降。 4.U266共培养诱导骨髓微环境中BMMSCs生物学特性的改变,可能在一定程度上促进了骨髓瘤病情的发展。


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