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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因

周阳  
【摘要】: 家蚕是重要的经济昆虫,也是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)的天然宿主。家蚕核型多角体病毒是引起家蚕病毒严重感染的关键病原之一,病毒与宿主的相互博弈一直是研究者们关注的问题。家蚕抗NPV机制至今尚未完全明确,但究其病因可归因于宿主与致病病毒两方面因素。 本研究以BmNPV核心基因Bm5为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位和基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能。同时使用家蚕高密度Oligo表达谱芯片所提供了相关基因的基因组学的证据,突破了以往单个基因孤立研究的局限,在全基因组范围内筛选家蚕抗NPV相关基因,对筛选出基因进行GO和Pathway分析,并进一步用半定量PCR和荧光定量PCR进行验证,探讨家蚕抗NPV的途径和机理。论文主要结论如下: 1.BmNPV的orf5(Bm5)位于基因组4,605--5,600 nt,全长993 bp,编码一个含331个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为39.3 kDa,Bm5是AcMNPV orf13的同源序列。在Bm5基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA,暗示了该基因是晚期表达基因。根据Bm5基因序列设计引物,分别以BmNP基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a(+),在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BM5蛋白的多克隆抗体。 2. RT-PCR分析发现,Bm5在病毒感染宿主细胞12 h开始转录,直到72 h。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm5的表达产物在病毒感染宿主细胞后24 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为39.3kDa,与预测的大小一致,说明Bm5是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子,表明BM5不是病毒粒子的结构蛋白。利用抗体检测发现BM5定位在细胞质中。 3.利用Red重组系统在大肠杆菌中成功地对BmNPV的Bm5基因进行了快速定点敲除。并BmNPV/Bac-to-Bac系统和Red重组系统结合在一起,对敲除了Bm5基因的BmNPV:进行了拯救。分别构建了野生型病毒vBm5-Wt、Bm5基因缺失病毒vBm5-Ko和Bm5基因拯救病毒vBm5-Re。 4.应用基因芯片技术在家蚕抗NPV品系BC8、感性品系306中筛查抗性相关基因,结果发现93个差异表达基因其中表达上调基因44个,下调基因49个。GO分析表明93个基因中51个其中24个上调基因、27个下调基因具有功能注释。GO分析结果显示分子功能方面主要有酶活性、氧化还原活性、酶绑定、结构成分、转运活性等;生物进程方面主要有新陈代谢、蛋白质水解、电子转移、蛋白质定位、转移、蛋白质生物等功能;细胞组分方面主要有细胞内、膜核糖体、胞外区等。Pathway分析表明有新陈代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酸代谢、核糖体、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、糖酵解/糖异和柠檬酸循环(TCA循环)等通路。 5.为了验证芯片筛选出差异表达基因,从93个差异基因挑选14个表达量差异大基因(9个上调基因、5个下调基因)进行RT-PCR,依据结果再从14个基因中挑选10个差异基因(7个上调基因、3个下调基因)进行荧光定量PCR。结果表明了7个上调基因中5个基因在NB、BC8各时间点的表达量高于306,鉴定为抗性相关上调基因,2个基因在BC8表达量高于NB、306。3个下调基因在306的表达量要高于NB、BC8,鉴定为抗性相关下调基因。表明荧光定量PCR试验结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性。


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