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黑木耳多糖的羧甲基化修饰及抗氧化活性研究

魏红  
【摘要】:黑木耳(Auricularia auricula)属木耳属,是药食两用真菌。研究表明,黑木耳多糖具有免疫调节、降血脂、降血糖、抗衰老、抗凝血等生物活性,有重要的研究和应用价值。但黑木耳多糖分子量大,水溶性较差,如何对多糖进行结构修饰改善其水溶性和活性是当今研究的热点课题之一。研究发现对多糖进行化学结构修饰(硫酸酯化法、羧甲基化法、磷酸酯化法等)可以提高多糖的水溶性,同时提高多糖的生物活性,目前未见对黑木耳多糖进行羧甲基化修饰等方面的研究报道。本文以黑木耳粗多糖为原料,制备羧甲基化黑木耳多糖,并对其分离纯化、结构和羧甲基化修饰前后黑木耳多糖的抗氧化活性进行研究,为黑木耳多糖功能食品和药物的研究开发提供科学依据。主要研究内容和结果如下: 1、研究了黑木耳粗多糖(AAP)的水提工艺。单因素和正交试验结果表明,最佳提取工艺条件为料液比1:70、温度100℃、时间4h、提取2次,pH为7.0。该工艺条件下粗多糖的得率为32.24%,多糖含量为64.23%;三因素对黑木耳多糖得率的影响次序为:温度料液比时间。 2、研究了羧甲基化黑木耳多糖的制备及分离纯化。采用溶媒法(异丙醇法)制备了羧甲基化黑木耳粗多糖(CMAAP),CMAAP的得率和羧甲基化取代度分别为61.36%和0.857;羧甲基化衍生前后多糖(即AAP和CMAAP)的溶解度分别为0.1 mg/mL和0.6mg/mL,羧甲基化黑木耳多糖的水溶性大大提高。采用DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶对羧甲基化黑木耳粗多糖进行分离纯化,得到5种多糖组分(CMAAP11、CMAAP22、CMAAP33、CMAAP44和CMAAP55)。经高效凝胶渗透色谱检测,峰形对称,说明纯化效果较好。 3、测定了各多糖组分的分子量和单糖组成。采用高效液相色谱法和气相色谱法测定各多糖组分的分子量和单糖组成。结果表明,CMAAP11、CMAAP22、CMAAP33、CMAAP44和CMAAP55的分子量分别为3400948、3460190、3549768、3675360和3743691;CMAAP111、CMAAP44和CMAAP55均由葡萄糖组成,CMAAP22和CMAAP33均由甘露糖和葡萄糖组成,其摩尔比分别为1.06:1和2.95:1。 4、表征了各多糖组分的结构。运用IR、NMR等现代分析手段及高碘酸氧化、Smith、刚果红等化学手段对各多糖组分进行表征。IR结果表明,各多糖组分均有羧甲基的特征吸收峰存在(在1600 cm-1、1420cm-1处均出现强吸收峰,为-COO-的特征吸收峰),表明黑木耳多糖己羧甲基化。NMR确定了各组分多糖结构中既存在α糖苷键构型,又存在β糖苷键构型;高碘酸氧化和Smith降解确定了各多糖组分的糖苷键类型及其比例;刚果红实验证明,CMAAP11、CMAAP22、CMAAP33、CMAAP44和CMAAP55不具有三螺旋立体构型。 5、研究了黑木耳粗多糖及羧甲基化黑木耳多糖的抗氧化活性。黑木耳粗多糖和羧甲基化多糖各组分对三种自由基(·OH、DPPH·、ABTS+)均有一定的清除作用,且羧甲基化修饰后多糖的抗氧化活性皆优于修饰前多糖,纯化后羧甲基化多糖的抗氧化活性优于纯化前。对于·OH,在浓度为2mg/mL时,经修饰的CMAAP33、CMAAP22和CMAAP的清除率分别为56%、52.13%和38.42%(修饰前AAP为27.75%);对于DPPH,在浓度为1.5mg/mL时,经修饰的CMAAP33、CMAAP22和CMAAP的清除率分别为79.34%、78.95%和63.03%(修饰前AAP为46.38%);对于ABTS+,在浓度为2mg/mL时,CMAAP33、CMAAP22和CMAAP的清除率分别为69.55%、65.53%和55.88%(修饰前AAP为38.30%)。本试验结果为抗氧化功能食品或药物的研究开发提供了依据。


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