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水稻白叶枯病菌受寄主诱导表达基因的鉴定及致病功能研究

沈晴  
【摘要】:水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括两个致病变种,分别是水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc)。其中,Xoo从水稻的水孔侵入,引起白叶枯病;Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病。一直以来,白叶枯病和细菌性条斑病是我国水稻生产上的两种重要的细菌病害。目前,对Xoo致病机理的研究主要集中在群体感应受体蛋白编码基因LuxR、无毒基因(如AvrXa7)、Ⅲ型分泌系统及其转运的效应因子、双组分调控系统(如PhoPQ双组分系统)、DSF型群体感应调控系统等基因和系统的功能分析,对于利用蛋白质组学,并从病原-寄主互作的角度来研究病原致病相关基因的研究则少有报道。 近年来,随着水稻和白叶枯病菌全基因组序列的公布,该病害已成为植物-病原物互作研究的重要模式之一。从病原-寄主互作层面来克隆病菌中新的致病因子,研究它们的致病功能与作用机制,对于深入认知Xoo的致病机制、设计病害控制策略具有重要意义。为此,本研究利用蛋白质组学技术,分离并鉴定了水稻白叶枯病菌PX099菌株与水稻感病品种IR24互作不同时期(3 h、6 h、12 h)时被共同诱导表达的8个蛋白。通过PCR的方法克隆了编码这些蛋白的8个基因,并分别构建了这8个基因的突变株。致病性测定结果表明:这8个基因中,有6个基因的突变株致病性均减弱。挑选其中致病性完全丧失的xanA基因(NC 010717.1)突变株做进一步研究,并通过表型测定明确了其对细菌生长、胞外多糖的合成、生物膜的形成、抗氧化压力能力和细胞形态等方面的影响。具体内容如下: (一)将水稻白叶枯病菌PX099与感病水稻IR24水稻叶片组织提取液共培养3h、6 h、12 h后分别提取细菌总蛋白。利用蛋白质双向电泳技术,质谱技术及ImageMaster 2D platinum 5.0软件对互作过程中的差异表达蛋白进行分析。结果表明:与对照相比,互作3 h和6 h时,病原菌中各有29个蛋白差异表达,互作12 h时,病原菌中有38个蛋白差异表达。其中,有8个蛋白在这3个时间点均有显著的差异表达。进一步的质谱分析结果表明:这8个蛋白分别为磷酸葡萄糖变位酶PGM(gi|84622382)、精氨酸酶(gi|84622054)、GroEL伴侣蛋白(gi|21229998)、膜定位蛋白MinD (gi|84624994)、细菌铁蛋白(gi|84623542)、肌醇-1-环鸟苷激酶(gi|84624213)、亚精氨合成酶(gi|58579842)、铁结合核蛋白(gil84622991)。通过在NCBI上进行比对,查找编码这8个蛋白的基因,分别为:xanA(YP_001915572.1)、rocF (YP_001915898.1)、groEL (YP_001911694.1)、minD (YP_001912473.1)、bfr (YP 001914071.1)、PXO 00388 (YP 001913112.1)、PXO 03650 (YP 001911408.1)、PXO_02027 (YP_001914882.1)。利用qRT-PCR (quantitative real-time PCR)对这8个基因在互作1 h、3 h、6 h、12 h、18 h时的转录水平进行分析,结果表明这8个基因在12 h、18 h时被最显著的诱导表达。 (二)根据水稻白叶枯病菌PXO99A的全基因组序列设计以上8个基因的引物,采用PCR方法从PX099中克隆了这8个基因,分别命名为xanA、rocF、groL、minD、bfr、imp、spd、pir。通过插入突变的方法,分别构建了这8个基因的突变株。利用剪叶法进行致病性测定,结果表明:除bfr、spd外,其余6个基因的突变株在感病水稻IR24上的致病性均减弱,其中,xanA基因的突变株致病性完全丧失。对xanA基因突变株进行生物膜、胞外多糖、HR反应等表型测定,结果表明:xanA基因的突变株生物膜形成受阻,胞外多糖产量降低,抗氧化压力能力减弱,细菌细胞形态发生改变。但是,在非寄主烟草上激发的过敏性反应情况与野生型菌株相似。


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