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PEG诱导的雨生红球藻细胞融合与变异株的筛选

王立新  
【摘要】:雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种生活在淡水里的单细胞绿藻,该藻由于能大量积累一种经济价值很高的红色素——虾青素(astaxanthin),因而成为继螺旋藻之后的另一种高经济价值的微藻。虾青素是良好的着色剂,并具有超强的抗氧化、捕获自由基、抗癌变,抗紫外线辐射、增强免疫等功能,在饲料、食品和化妆品等领域有着广泛的市场需求。目前国内外虾青素的产量远远达不到市场的需求,国内外都在大力推动规模化养殖雨生红球藻,实现虾青素的商业化生产。但规模化养殖雨生红球藻仍存在许多问题,如养殖过程中生长较慢、产量较低,同时易被其他微藻、原生动物、细菌等污染。因此选育高产的藻种是解决上述问题的重要关键。 本研究选用不同体积浓度的PEG(聚乙二醇)作为细胞融合诱变剂,在不同Ca2+浓度、二甲基亚砜浓度、处理时间、细胞接触方式等因素作用下,诱导雨生红球藻细胞发生融合杂交变异,采用正交试验设计,测定不同PEG体积分数、Ca2+浓度、二甲基亚砜浓度、反应时间及雨生红球藻细胞间的接触方式对雨生红球藻细胞融合率的影响。 试验结果显示采用摇晃摔打法的细胞接触放式时,55%PEG的浓度、25mg/1000ml的Ca2+浓度、10%的二甲基亚砜浓度、25℃下处理10min可以取得较高的雨生红球藻细胞融合率,即A4B2C3D2是最佳处理因素组合。在采用摇晃摔打加离心重力挤压的细胞接触方式时,50%PEG的浓度、25mg/1000ml的Ca2+浓度、5%的二甲基亚砜浓度、25℃下处理10min可以取得较高的雨生红球藻细胞融合率,即A离3B离2C离2D离2是最佳处理因素组合。 通过固体培养基分离筛选培养法(简称固筛法)和离心重力分离筛选培养法(简称重筛法),培养一段时间后,在40倍显微镜下观察雨生红球藻细胞团的分裂数目,并测量其雨生红球藻细胞的直径,把细胞团中细胞数大于8、细胞直径大于25umn的细胞团筛选出来,结果筛选出20株细胞肥大且分裂速度快的雨生红球藻细胞株系。此结果表明离心重力分离结合固体平板培养基培养,在40倍显微镜下操作,可以快速筛选出细胞肥大、分裂生长速度快的雨生红球藻细胞株系。 对筛选得到的20株细胞肥大、分裂生长速度快的雨生红球藻细胞株系进行MVA液体培养基培养,先在2000Lux低光照条件下培养测定其生长速率,再在5000-6000Lux中等强度光照条件下培养,测定各选择雨生红球藻株系的虾青素积累量和单位培养液体积内的虾青素产量,综合生长速率、虾青素含量与产量等各项指标,最后筛选出P5、P12、P20等雨生球藻高产株系,生长速率分别比原始出发株提高30.23%、19.86%、19.16%,虾青素产量分别比原始藻株提高72.12%,73.96%,63.89%。 将经过系列筛选得到的P5、P13、P20等雨生红球藻高产株系培养四、五代后详细测定其生长速率和虾青素含量,各筛选株的各项特征基本稳定,每个世代的细胞密度及虾青素产量基本比较稳定遗传,表明筛选到的高产变异藻株遗传性能稳定。


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