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牛半腱肌中多聚磷酸酶酶学特性及其反应体系动态研究

孙珍珍  
【摘要】:磷酸盐是肉品加工中常用的品质改良剂,且磷酸盐混合物的作用效果优于单一磷酸盐,但是添加的磷酸盐在肉品中会被水解而失去作用。本文从牛肉半腱肌中纯化焦磷酸酶和三聚磷酸酶,研究了其酶学特性,并将纯化的酶与单一磷酸盐和磷酸盐混合物(TSPP:STPP:HMP=2:1:1)进行反应,通过”P NMR技术鉴别和量化体系中的不同磷酸盐反应物的动态变化过程,得出如下结果: 1、牛肉半腱肌中焦磷酸酶分离纯化及特性研究 试验建立了牛肉半腱肌中PPase的分离纯化方法:将牛肉半腱肌匀浆物经0.25M蔗糖和0.6M NaCl提取、50-70%饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAE-52离子交换柱层析得到有PPase活性的单峰,经SDS-PAGE鉴定得到该酶的分子量为72KDa。以TSPP为底物,对焦磷酸酶的研究表明该酶初速度反应时间为0-25min,最适pH为6.8,最适温度为47℃,Mg2+、Ca2+在低浓度条件下对酶活性影响很大,0-10mM Mg2+酶活性迅速升高,当Mg2+浓度高于10mM时活性达到稳定,低浓度Ca2+抑制活性,当浓度达到25mM时几乎检测不到活性。当浓度低于10mM时,EDTA-Na4比EDTA-Na2有更强的抑制作用;当浓度高于10mM时抑制作用趋于稳定,但与Ca2+的抑制效果不同的是EDTA-Na2和EDTA-Na4没有完全抑制活性。 2、牛肉半腱肌中三聚磷酸酶分离纯化及特性研究 试验建立了牛肉半腱肌中TPPase的分离纯化方法:将半腱肌匀浆物经盐溶液提取、调离子强度、35%-50%饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAE-52离子交换柱层析得到有TPPase活性的单峰,通过SDS-PAGE鉴定得到该酶的分子量为225KDa,该分子量刚好与肌球蛋白重链的分子量一样。以STPP为底物,对三聚磷酸酶的作用研究表明该酶的初速度反应时间为0-25min,,最适pH5.8,最适温度28℃,在0-10mM条件下Mg2+对酶有较强的激活作用高于10mM浓度的Mg2+对TPPase活性有维持作用,当Ca2+浓度从0增加到1mM时,酶活性迅速下降,当浓度高于8mM时,活性几乎不受影响。EDTA-Na2和EDTA-Na4对酶活性均有抑制作用,当浓度低于15mM,EDTA-Na2比EDTA-Na4的有更大的抑制作用。 3、纯化的焦磷酸酶和三聚磷酸酶与磷酸盐反应体系的动态研究 将纯化的牛肉半腱肌焦磷酸酶和三聚磷酸酶与磷酸盐进行反应,采用”P NMR技术测定不同时间下体系中的磷酸盐存在形式及量的变化,结果表明:在三聚磷酸酶和焦磷酸酶共同作用下,三聚磷酸盐水解成焦磷酸盐,派生的焦磷酸盐继续水解成单磷;在三聚磷酸酶和焦磷酸酶相同活力的条件下,三聚磷酸盐水解成焦磷酸盐的速度快于焦磷酸盐水解成单磷的速度;焦磷酸四钠、磷酸盐混合物分别与焦磷酸酶反应,后者反应体系中焦磷酸盐积分面积远远大于前者,且单磷峰高远远低于前者,表明磷酸盐混合物抑制了焦磷酸盐的水解;三聚磷酸钠、磷酸盐混合物分别与三聚磷酸酶反应,后者反应体系中焦磷酸盐积分面积远远大于前者,且单磷峰高远远低于前者,表明磷酸盐混合物抑制了三聚磷酸盐的水解;当焦磷酸酶和三聚磷酸酶同时存在时,并分别与三聚磷酸钠和磷酸盐混合物反应24.5h,三聚磷酸盐体系中的三聚磷酸盐全部水解成单磷,而磷酸盐混合物体系中还有焦磷酸盐存在,且积分面积为22.48,表明磷酸盐混合物抑制了三聚磷酸盐的水解。结果阐明,磷酸盐混合物的作用效果优于单一磷酸盐的主要原因是磷酸盐混合物抑制了三聚磷酸盐和焦磷酸盐的水解。


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