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警犬黄曲霉毒素中毒后血浆内源性代谢物的GC-MS分析

刘亚玲  
【摘要】:黄曲霉毒素(afaltoxin, AF)是黄曲霉菌、寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在于霉变的动物饲料中。AFB1是一种毒性极强的肝毒素,动物采食含有AF的饲料后主要引起肝脏损伤。而肝脏是机体物质代谢的枢纽,承担了大部分的合成、分解、转化和排泄等代谢过程,一旦受损,将导致糖类、脂类、氨基酸等物质的代谢紊乱。因此从代谢的角度对黄曲霉毒素中毒进行研究非常重要。代谢组学(Metabonomics)能够反映细胞、体液的内源性和外源性代谢物浓度与机体功能之间的关系,已在医学、生物学等众多领域得到广泛的应用。而气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术具有较强的分离分析能力,灵敏度高,操作简便,而且有商品化的标准质谱数据库,可对代谢物的结构进行快速鉴定,适合于代谢组学分析。目前将代谢组学技术应用于警犬AF中毒的研究在国内外还未见报道。因此,本论文以AF中毒犬的血浆为研究对象,通过化学衍生化反应对代谢物进行修饰,建立了基于代谢组学的GC-MS分析方法,研究警犬AF中毒后血浆代谢物的变化,主要研究内容如下: 1.警犬血浆内源性代谢物谱的GC-MS分析方法的建立 以健康犬血浆为分析对象,研究建立了内源性代谢物谱的GC-MS分析方法。在对血浆样品的制备方法,色谱分析条件进行综合考察的基础上,获取了一个峰容量大、分离效果佳的GC-MS分析条件,并对其进行了方法学验证。结果表明,建立的GC-MS分析方法稳定可靠,能较好地表征血浆样品的代谢物谱特征,可望用于代谢组学研究。 2.警犬血浆内源性代谢物的GC-MS分析 利用气相色谱-质谱(GC-MS)技术对德国牧羊犬,史宾格犬和拉布拉多犬三个警用品种健康犬的血浆进行分析研究。峰挑选后发现三个不同品种健康犬的血浆中有38种共有内源性代谢物,主要是氨基酸、脂肪酸,糖类等小分子量的化合物。通过对检测到的38种共有的内源性代谢物比较分析,发现部分代谢物的含量在三个品种之间存在差异。本章实验所得到的健康犬血浆内源性代谢物谱为黄曲霉毒素中毒犬血浆内源性代谢物的检测提供了一个依据。 3.黄曲霉毒素中毒犬血浆代谢组的GC-MS分析 运用代谢组学方法研究黄曲霉毒素(aflatoxin, AF)对犬肝脏的损伤作用。通过气相色谱-质谱技术(GC-MS)分析AF中毒犬血浆中的代谢物谱,使用主成分分析(PCA)法研究犬AF中毒后血浆内源性代谢物谱的变化情况。结果表明,犬AF中毒后,血浆内源性代谢物谱随中毒时间的推移发生了相应的变化。血浆中的部分氨基酸(如L-异亮氨酸、甘氨酸、L-苏氨酸等)含量升高,葡萄糖、胆固醇以及部分游离脂肪酸(如软脂酸、硬脂酸等)含量下降。这些代谢物的变化与肝脏的损伤程度存在着一定的关系,而且其变化趋势与血液生化指标检测结果一致。由此可见,基于GC-MS的代谢组学技术能较全面地反应生物体的代谢状态,再结合PCA对血浆代谢物的变化进行模式识别,可望成为诊断AF中毒的一种新手段。


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