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水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)对链霉素和噻枯唑的抗药性监测和抗药性机制研究

徐颖  
【摘要】:水稻白叶枯病是水稻上的重要病害之一。噻枯唑和链霉素是我国防治水稻白叶枯病最主要的两种药剂,这两种药剂在我国的使用历史均在三十年以上,开展抗药性监测工作和抗药性机制研究十分必要。本论文围绕上述目的进行了以下研究:(1)水稻白叶枯病菌实验室链霉素抗性菌株的诱导及其抗药性分子机制和风险研究;(2)水稻白叶枯和细菌性条斑病菌对链霉素田间抗药性监测;(3)水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株的抗性分子机制研究;(4)水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性机制的初步研究;(5)水稻白叶枯病菌对噻枯唑田间抗药性监测。 1.水稻白叶枯病菌实验室链霉素抗性菌株的诱导及其抗药性分子机制和风险研究 通过紫外光照射诱变获得了6株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)链霉素抗药性突变体。链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(minimal inhibition concentration, MIC)分别为0.10μg/mL和600μg/mL;对敏感菌株ZJ173的有效中浓度(medium effective concentration, EC50)为0.03μg/mL,对抗性菌株的平均EC50为11.64(3.15-23.75)μg/mL,平均抗性倍数(resistance factor,抗药性突变体与敏感菌株的EC50的比值)为388倍。 通过PCR扩增检测了可能会引起链霉素抗药性的基因,包括rpsL基因(编码S12蛋白)、rrs基因(编码16S rRNA)和strA基因(编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶),测序结果表明被测的5株抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在43位(Lys→Arg)发生了突变,另外1株在88位(Lys→Arg)发生了突变;rrs基因与敏感菌株相比未发生突变,也未检测到strA基因。上述结果表明实验室诱变的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性可能是由rpsL基因突变引起的。 研究结果还表明抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,致病性、生长速率与敏感菌株无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗药性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此这一类型抗性突变体的抗药性风险较高。 2.水稻白叶枯和细菌性条斑病菌对链霉素田间抗药性监测 本研究于2007-2008年从我国水稻主产区采集了534株水稻白叶枯菌株和827株水稻细菌性条斑菌株,并测定了它们对链霉素的敏感性。发现4株来自云南思茅普洱县的水稻白叶枯菌株对链霉素具有抗药性,占测定菌株的0.75%,平均抗药性倍数为226倍。本研究首次报道了水稻白叶枯病菌田间抗性菌株的存在。除了这4株高水平抗药性菌株外,来自云南的水稻白叶枯病菌中还存在敏感性显著降低的群体-亚敏感群体。对水稻细菌性条斑病菌的抗药性监测中未发现敏感性下降的菌株。 3.水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株的抗性分子机制研究 已知在其它植物、动物或人类病原细菌中引起链霉素抗药性的的分子机制主要有rpsL(编码S12蛋白)和rrS(编码16S rRNA)基因突变以及strA-strB基因和aadAl基因的存在。本研究通过PCR扩增和基因测序,比较了抗性和敏感菌株的上述基因,发现抗性菌株的rpsL和rrS基因并未发生突变,也未发现strA基因的存在,而4株水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株中均含有Ⅰ型整合酶基因intⅠ和编码链霉素修饰酶的基因-氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶基因aadAl,而这两个基因在ZJ173和24个随机选取的田间敏感菌株中均不能扩增得到,这一结果表明4株抗性菌株的链霉素抗药性是整合子中的aadAl基因导致的。本研究首次报道了植物病原细菌中抗药性整合子的存在。 对4株抗性菌株NA7-1、YNA10-2、YNA11-2、YNA12-2的整合子序列进行了扩增,分别得到4041、3173、3801、3251bp的扩增产物,之后对它们进行了基因测序和比对分析。同时对4株抗性菌株采用药敏纸片扩散法和最低抑制浓度法(MIC)对多种抗生素的抗药性进行了检测。结果表明,YNA7-1和YNA11-2的整合子中含有按如下顺序排列的基因盒:aac(6')-Ⅱ-arr-3-aadA1,其中aac(6)-Ⅱ编码对妥布霉素、庆大霉素、奈替米星和卡那霉素的抗药性,arr-3编码对利福平的抗药性,aadAl编码对链霉素和壮观霉素的抗药性;相比于YNA7-1,YNA10-2缺失了aac(6)-Ⅱ,只含有arr-3-aadA 1基因盒;YNA12-2缺失了包含部分intⅠ基因的550bp的中间序列,其整合子中仍含aac(6')-Ⅱ-arr-3-aadA1基因盒。除YNA7-1和YNA12-2未表现出arr-3编码的对利福平的抗药性外,其余基因编码的抗药性表型均与基因型吻合。除缺失序列外,4个抗性菌株的整合子序列中的核苷酸序列是完全相同的。通过与GenBank中的序列比对可知,没有整合子中的基因盒排序同本实验中的整合子相似。4个抗性菌株中序列相同的aadA1基因与在GenBank中与其相似性最大的aadA1基因的序列第79位密码子编码的氨基酸不同,本研究中为Gly(甘氨酸),而不是Glu(谷氨酸)。 本研究对4株抗性菌株后代的抗性稳定性及aadA1基因与整合酶intⅠ基因进行了检测,检测结果表明在YNA7-1和YNA12-2中,抗药性及相关基因均稳定存在于后代中,而在YNA10-2和YNA11-2中不稳定。 4.水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性机制的初步研究 通过多次紫外光照射诱变未能获得离体水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性菌株。通过水稻活体上噻枯唑的药剂筛选,获得了3株活体噻枯唑抗药性菌株。噻枯唑对水稻白叶枯敏感菌株有很好的预防和治疗效果,100μg/ml噻枯唑处理1d后接种,对白叶枯病的预防效果为93.6%。接种1d、3d、5d后用100μg/ml噻枯唑处理的治疗效果分别为86.84%、73.76%和51.60%。然而,该剂量处理对抗药性菌株几乎没有保护和治疗作用。甚至用1200μg/m1噻枯唑处理,对抗药性菌株的最好预防效果只有50.14%。 这些抗药性菌株无论是经过无药培养基平板10次转代培养,还是接种在未处理的水稻上发病后再分离1次,他们仍然在水稻上表现对噻枯唑的抗药性。离体培养基上测定结果表明,在水稻上表现对噻枯唑对抗性的这些菌株,在离体条件下仍然对噻枯唑表现敏感,生长抑制率并未明显改变。 本研究通过两轮施药接种,测定了不同浓度的噻枯唑对水稻白叶枯病菌的叶发病率、叶片菌落回收率及抗性菌株的比率的影响,结果表明随着噻枯唑处理浓度的增加,水稻白叶枯的叶发病率和叶片菌落回收率下降,至600μg/mL处理浓度时,叶片菌落回收成功率仅为5.56%。但在小于等于600μg/mL时,从发病叶片和不发病叶片中均可回收到白叶枯病菌,从不发病叶片中回收的成功率略低于发病叶片。噻枯唑处理浓度为100μg/mL和300μg/mL时,回收菌落中抗药性菌株所占的比率较高,尤以300μg/mL浓度处理时,抗药性菌株所占比率最高,发病叶片和不发病叶片中的抗药性菌株比率分别达到了31.90%和28.57%。 对抗药性菌株和敏感菌株后代的均一性检验结果表明,在水稻活体上,敏感菌株可以在药剂的筛选压力下产生新的活体抗药性菌株,而活体抗性菌株的后代则稳定地保持了抗药性。 通过烟酰胺的反转抑制作用比较了噻枯唑与其结构类似物敌枯唑ATDA的作用机制的异同。结果表明,离体条件下噻枯唑和敌枯唑对白叶枯病菌的ECso分别为0.79和91.83μg/mL,噻枯唑对白叶枯病菌的抑制作用远高于敌枯唑。烟酰胺不能反转噻枯唑的抑菌作用,但可以反转敌枯唑的抑菌作用。因此离体条件下,噻枯唑与敌枯唑的作用机制可能是不同的。但在活体条件下,噻枯唑和敌枯唑具有明显的正交互抗药性,表明在活体上噻枯唑与敌枯唑可能有相似的作用机制。 5.水稻白叶枯病菌对噻枯唑田间抗药性监测 2007-2008年,本研究自我国七个省(云南、江苏、安徽、湖北、广东、海南、湖南省),48个县采集并分离了654株水稻白叶枯病菌,对其中的409株通过活体接种进行了对噻枯唑抗药性的监测。依据300μg/mL噻枯唑对田间分离菌株的相对抑制率分布频率,建立了水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗性菌株和敏感菌株的鉴别标准:300μg/mL噻枯唑处理下,对所测菌株的致病抑制率低于对参照菌株ZJ173抑制率的70%时,该菌株被鉴别为抗药性菌株。依此标准,对来自我国水稻主产区的409株水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性进行了监测,结果表明抗药性菌株所占比例为12.71%。其中来自江苏省和云南省的菌株中,抗药性菌株比例最高,分别为19.21%和14.29%;来自湖北和海南两省的菌株中未监测到噻枯唑抗性菌株。


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