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拟南芥磷脂酶D和磷脂酸对微管形态和NADPH氧化酶活性调控机制的研究

张群  
【摘要】:干旱和盐害是限制粮食生产的主要的非生物逆境。逆境诱发细胞膜系统受损、DNA降解、营养亏缺、细胞死亡等,导致作物产量和质量的下降。更多了解植物对干旱和盐害的内部响应系统、各系统间的互作和网络关系,以及相关的调节机制,有利于我们改良作物抗干旱和盐害能力,提高作物产量和质量。 拟南芥基因组含有12个PLD基因,它们具有不同的结构、生化和调节特性,参与不同的生理生化和细胞调控过程。我们以模式植物拟南芥为研究对象,研究磷脂酶D (PLD)和磷脂酸(PA)对植物微管结合蛋白MAP65-1(Microtubule Associated Protein65-1)的调控,及其对细胞微管稳定和耐盐性的影响。我们得到TUA6-GFP与pldα1杂交的纯合体,蛋白杂交结果表明PLDα1蛋白已被敲除。50 mM NaCl处理下,pldα1子叶和下胚轴表皮细胞的微管更易解聚,导致表皮细胞大量死亡;外源PA能缓解由NaCl引起的细胞死亡。结果表明:较长时间(24h)的盐处理下,PLD的产物PA参与维持下胚轴微管的稳定。在2μM微管解聚剂oryzalin处理下,与野生型拟南芥相比,pldα1显示出更严重的下胚轴微管解聚和细胞死亡;外源PA能使pldα1恢复到野生型的表型。Oryzalin可在短时间内激活PLDα1。这些结果表明,盐胁迫下,微管结构的解聚是导致细胞和植株死亡的重要原因;PLDα1和PA是维持盐胁迫下细胞微管结构稳定的重要因子。 为了深入研究PLDα1和PA调节微管结构的机理,我们研究了PA和微管结合蛋白MAP65(Microtubule-Associated Protein 65)的作用关系。拟南芥基因组中存在9个MAP65基因。我们在大肠杆菌细胞中异源表达MAP65-1、MAP65-5、MAP65-6MAP65-8等四个重组蛋白,利用脂蛋白杂交和荧光免疫共沉淀技术,研究了PA-MAPs的结合。结果显示PA与MAP65-1结合最强,与MAP65-5和MAP65-8结合较弱,与MAP65-6结合最弱。拟南芥叶肉细胞中,NaCl处理促进MAP65-1蛋白与PA的结合。体外实验表明,PA可提高MAP65-1与微管的结合,促使微管形成更多的微管束,维持微管的稳定。在拟南芥叶肉细胞原生质体中,过表达MAP65-1蛋白显著提高WT的耐盐性,而对pldα1的耐盐性作用较小;外源补充PA可提高过表达MAP65-1的pldα1的耐盐性。 利用脂蛋白杂交和荧光免疫技术,研究PLD与微管、MAP65-1蛋白的关系。结果显示,PLDα1蛋白本身均不与微管蛋白α、β亚基,或MAP65-1蛋白结合;PA也不与微管蛋白α或β亚基结合。PLD 6为微管结合蛋白,且与另一微管结合蛋白MAP65-1不结合;用低盐处理(25mM NaC1)处理原生质体,pldδ的微管结构变化与野生型一致,但plsα1突变体在此盐浓度下,表现为断裂微管数量增加。上述结果表明,PLDα1的产物PA,通过结合MAP65-1与微管相连。另外,map65-1突变体表现为盐敏感性,与pldα1表型相似。综上结果,推测,拟南芥细胞可能存在PA-MAP65-1-微管复合体,此复合体对于维持在盐胁迫后期微管结构和功能的稳定性,提高拟南芥对盐害耐受能力是必需的。 外源ABA和Ca2+可诱导野生型拟南芥子叶保卫细胞微管的解聚和气孔的关闭,而对pldα1作用较小。PPM和oryzalin均能解聚保卫细胞的微管,但不诱导气孔关闭。在pldα1中,补充PA或者同时加入微管解聚剂和ABA,均可诱导微管的解聚和气孔关闭。ABA和微管解聚剂均诱导野生型和pldα1保卫细胞Ca2+浓度升高,其中pldα1响应相对缓慢。结果表明,ABA诱导开放气孔关闭可能存在一条细胞骨架系统、钙信号和PLDα1/PA互作的复杂信号途径。 我们还研究了拟南芥保卫细胞中PA对保卫细胞NADPH氧化酶(Rboh)的调控作用。拟南芥基因组有10个NADPH氧化酶催化亚基,已知RbohD和RbohF基因在保卫细胞表达。在rbohD保卫细胞的原生质体中,过表达RbohD蛋白显著提高保卫细胞ROS (Reactive Oxygen Species)的含量,PA处理极显著提高ROS含量。当RbohD N端的四个精氨酸位点(149,150,156,157)突变成丙氨酸后,RbohD不能与PA结合。保卫细胞中过表达不与PA结合的RbohD,ROS含量并不升高,PA处理效果也随之消失。在过表达不与PA结合的RbohD的植株中,外源ABA处理不能促使保卫细胞ROS的升高,也不能诱导子叶气孔的关闭。以上研究结果表明,外源ABA可激活保卫细胞的PLDα1,产生的PA结合并激活质膜上的NADPH氧化酶,产生活性氧,导致气孔的关闭。结果也暗示,在ABA促进开放气孔关闭的途径中,PA对RbohD活性的调控,可能是ABA促进开放气孔关闭的途径中ROS重要调节机制之一。


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