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纳米茶多酚的制备及其抗肿瘤作用研究

梁进  
【摘要】:茶叶是我国具有悠久历史和深刻文化底蕴的特色经济作物,也是当前世界三大饮料中最具有生命力,最受消费者欢迎的文明健康饮料。茶叶中含有丰富的化学成分,包括多酚类、咖啡因、茶色素、茶多糖、茶皂素和茶氨酸等多种对人体健康有益的天然产物,具有抗氧化、抗突变和防癌抗癌等广泛的生物学活性,其开发应用前景也十分广阔。 本文基于绿茶中的主要功效成分茶多酚所具有的防癌与抗癌作用,采用现代生物活性物质提取与分离技术,获得纯度较高的茶多酚,并以两种水溶性壳聚糖为载体,通过离子凝胶法制备纳米茶多酚,优化纳米茶多酚的制备工艺,筛选纳米茶多酚的最佳粒度和包封率,并分析纳米粒的粒径分布和体外表征。采用生物学前沿技术和手段,建立人肝癌HepG2肿瘤细胞培养模型以及肿瘤动物模型,研究纳米茶多酚的抗肿瘤作用,通过显微镜和透射电镜的形态学观察、酶标仪以及流式细胞术等方法,探讨纳米茶多酚的抗肿瘤作用机理。 主要研究结果如下: 1.绿茶采用超微加工技术可以显著提高茶多酚的有效溶出。本研究结果显示,绿茶原料经超微碎粉后茶多酚的溶出量由原来的156.34±4.22 g/kg提高到272.67±9.56 g/kg。茶多酚的分离纯化主要采用有机溶剂法与大孔树脂法相结合进行,获得的茶多酚纯度为93.75%,产品得率达到6.14%。高效液相色谱分析表明,纯化的茶多酚与有机溶剂提取的粗多酚相比,儿茶素的含量较高,且咖啡因的含量有所降低。 2.以羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐为载体,利用分子自组装技术在溶液中制备纳米茶多酚,通过Box Behnken试验设计和响应曲面法优化纳米茶多酚制备工艺,获得粒径较小且包封率较高的纳米茶多酚。动态光散色仪检测结合透射电镜观测显示,纳米粒形态不规则,但分布较为均匀,其粒径大多在200 nm-400 nm范围内,Zeta电位值为30 mV左右,在溶液中呈现相对稳定的胶体状态。以壳聚糖制备的纳米粒是一种优良的缓释载体,纳米茶多酚在溶液的显示了较强的缓释性能,在PBS为7.4的缓冲溶液中纳米茶多酚的体外缓释时间可达48 h。纳米茶多酚经冷冻干燥后室温下保存,稳定性良好。 3.主要通过溶血性试验、细胞毒性试验和急性毒性试验研究纳米茶多酚的体内外安全性。结果显示,纳米茶多酚无溶血和凝集现象;对L929细胞的相对增殖度为(100.03±0.06)%,毒性分级结果显示为无毒性。急性毒性试验显示,最大灌服剂量为3 g/kg BW纳米茶多酚以及2.55 g/kg BW勺空载纳米粒均对小鼠无明显影响。由此表明,纳米茶多酚以及壳聚糖纳米粒载体在此剂量范围内均为安全的,对机体无毒性。 4.体外抗肿瘤作用结果表明,纳米茶多酚(0.5 mg/mL-1.0 mg/mL)对人肝癌细胞HepG2有明显的生长抑制作用,并呈剂量与时效关系。透射及扫描电镜结果表明,纳米茶多酚作用于人肝癌HepG2细胞后,细胞变小,胞膜皱缩,细胞核固缩,致密浓染并伴有核型的不规则变化,出现核碎裂等凋亡的典型特征,表明纳米茶多酚可明显诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡。 5.流式细胞术检测纳米茶多酚对HepG2细胞周期与细胞凋亡影响,结果表明,浓度为1.0 mg/mL勺纳米茶多酚处理HepG2细胞24 h后,早期凋亡及晚期凋亡的细胞分别占总检测数的23.83%及3.30%,明显高于未给药对照组2.44%和2.89%,相同浓度的纳米茶多酚可使HepG2细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期(对照组为0.62%,给药组为5.54%),阻断细胞周期向S期进行,阻止细胞增殖,诱导细胞凋亡。 6.通过建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,并结合体内抗氧化实验及病理技术,测定小鼠移植瘤体积、抑瘤率以及瘤块组织形态学变化,研究纳米茶多酚的体内抗肿瘤功效及初步探讨其作用机制。试验结果显示,纳米茶多酚对小鼠H22肝癌移植瘤具有显著的体内抗肿瘤作用,6.0、12.0 mg/kg剂量纳米茶多酚处理后抑瘤率分别达到51.50%和58.17%;体内抗氧化实验结果表明,纳米茶多酚可显著提高荷瘤小鼠血清T-AOC活性,同时降低肝脏H202含量以及SOD活性;病理检测结果表明,纳米茶多酚使肿瘤组织周边结缔组织增多,呈现细胞凋亡特征。


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