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EHEC O157:H7 Stx2B-Tir-Stx1B-Zot重组菌的构建及其免疫原性的研究

张雪寒  
【摘要】:食源性病原微生物是当今世界上不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。其中,肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157:H7可致人腹泻、出血性结肠炎、还可在5%-10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS)及血栓性血小板减少紫癜等严重并发症,严重者可致死亡。近20余年来,EHEC O157:H7引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。 在我们研究中选用EHEC O157:H7三个主要的毒力基因tir. stx2b和stx1b,运用原核表达系统在体外进行串联表达,获得重组蛋白。选择能够增强肠通透的霍乱弧菌封闭小带毒素zot基因进行串联,希望能够增强机体的粘膜免疫,尤其是肠道的粘膜免疫。选用链霉素处理的Balb/c小鼠作为评价动物,皮下和鼻腔两个途径免疫Stx2B-Tir-Stx1B-Zot蛋白,通过测定血清中的IgG滴度和IgA滴度、粪便中的IgA滴度以及粪便排菌来衡量Stx2B-Tir-Stx1B-Zot蛋白的免疫原性,为EHEC O157:H7亚单位疫苗的研制筛选良好的免疫原。 1.肠出血性大肠杆菌0157:H7 tir基因重组蛋白的表达及鉴定 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157:H7转位紧密素受体(tir)基因,并研究其免疫原性。选用pET28原核表达载体,构建pET28-tir重组质粒,并在大肠杆菌BL21中进行高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。结果显示成功获得高效表达的重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与EHEC O157:H7(?)勺天然Tir蛋白发生特异性抗原抗体反应。我们在大肠杆菌中成功克隆表达了tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的反应原性。 2.大肠杆菌O157:H7 Tir重组蛋白的生物学特性 以HEp-2细胞为模型,评价重组Tir蛋白制备的抗体是否能够抑制(?)EHEC O157:H7的粘附和A/E损伤的形成。应用纯化后的重组Tir蛋白,皮下免疫Balb/c小鼠进行免疫保护性实验。两免断尾采血,间接ELISA测定血清特异性抗体效价。二免14d,10’。CFUEHEC O157:H7口服灌胃攻毒。每隔两天采集粪便检测排菌量。结果显示:表达的Tir蛋白具有天然Tir蛋白的功能特性,其抗体能够较大程度地抑制EHEC 0157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤的形成。二免Balb/c小鼠存活率高达100%,排菌减少,8d后检测不到排菌,而对照组在第16d仍然能检测到排菌。因此,体外表达的重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可作为EHEC O157:H7基因工程疫苗研制的首选抗原之一 3.肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2B-Tir-StxlB-Zot多价融合蛋白表达及鉴定 EHEC O157:H7主要定植在肠道内,研制能够增强粘膜免疫基因工程疫苗具有很大优势。构建表达tir和stxb的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stXB亚基基因72个氨基酸串联构建ppGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,并与霍乱弧菌封闭小带毒素(Zot)靠近C端基因串联,构建重组质粒pGEX-stx2b-tir-stxl b-zot,转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,主要以可溶性形式存在于菌体胞浆中。Western blot鉴定显示,Stx2B-Tir-Stx1B-Zot具有良好的反应原性。 4.大肠杆菌O157:H7 Stx2B-Tir-StxlB-Zot重组蛋白的免疫原性 Stx2B-Tir-Stx1B-Zot重组蛋白,分别皮下和鼻腔免疫Balb/c小鼠,二次免疫后测定血清中IgG和IgA滴度,粪便中IgA滴度。定期采集粪便,测定粪便排菌情况。结果显示:鼻腔免疫后Balb/c小鼠存活率100%,攻毒7d后检测不到排菌,并且最高排菌量只有3×103CFU/0.1g,血清中IgG滴度接近105,粪便中IgA接近102;皮下免疫后Balb/c小鼠存活率88%,攻毒9d后检测不到排菌,并且最高排菌量只有1.1×105CFU/0.1g,血清中IgG滴度也接近105,粪便中检测不到IgAStx2B-Tir-Stx1B-Zot鼻腔免疫能够发挥更好的免疫原性,可以作为EHEC 0157:H7亚单位疫苗研制的免疫原。


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