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猪源乳酸杆菌的筛选及其对仔猪肠道黏膜免疫影响的研究

张锦华  
【摘要】:本试验从健康仔猪十二指肠黏膜分离筛选到一株唾液乳酸杆菌(L. sarlivariusB1),体外试验结果表明L. sarlivarius B1产酸能力及与上皮细胞粘附能力均较强。采用新生仔猪为对象,研究L. sarlivarius B1对仔猪黏膜免疫的影响及其作用机制,并以大肠杆菌E. coli k88为指示菌感染仔猪,进一步研究L. sarlivarius B1抵抗大肠杆菌E. coli k88感染的影响。 1.猪源乳酸杆菌的分离与鉴定 首先从四种不同品种的30日龄仔猪(长白猪、山东莱芜黑猪、杜洛克猪、贵州巴马小香猪)十二指肠黏膜分离到36株乳酸杆菌,然后对36株乳酸杆菌体外产乳酸、在Caco-2细胞表面的粘附力以及抗生素敏感性进行测定。从中筛选出10株产酸能力和粘附力强的的乳酸杆菌,最后通过PCR-DGGE图谱技术对10株纯菌分离株和四个品种猪的十二指肠黏膜乳酸杆菌进行对比,分析所分离的乳酸杆菌在仔猪十二指肠黏膜分布情况,最后选取其中的4株菌进行16S rRNA分子鉴定。结果表明:36株乳酸杆菌产酸性能力和粘附力存在一定的差别,10株产酸能力强的乳酸杆菌与上皮细胞的粘附能力均比参考菌株L.brevis1.2028和L. acidophilus(ATCC4356)强,16S rRNA基因序列分析显示,所测4株乳酸杆菌均与唾液乳酸杆唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius)同源性高达98%,部分序列已被Genbank收录,登录号为GQ303717和GQ303718。选取产酸能力与粘附力最强的L. sarlivarius B1为益生菌候选菌株。 2. L. salivarius B1对仔猪小肠发育的影响 应用筛选出的L. sarlivarius B1饲喂新生仔猪,研究L. sarlivarius B1对仔猪生产性能和小肠发育的影响,试验选择6窝初生重、胎次相近的新生仔猪为研究对象,分成乳酸杆菌组、对照组和商品日粮组。乳酸杆菌组分别于仔猪0、7、11、26日龄灌喂L. salivarius B1(菌液离心后用蔗糖溶液调至活菌数为5×109cfu/m1),对照组则饲喂同体积的蔗糖溶液,乳酸杆菌组和对照组仔猪均从7日龄开始饲喂无抗开食料,商品日粮组则饲喂商品仔猪料。28日龄称重后每窝随机选择2头仔猪宰杀,随后取小肠固定,制作组织切片、染色。测定肠绒毛高度和肠道上皮内淋巴细胞和IgA分泌细胞数量。试验结果显示:L. salivarius B1能够显著地提高仔猪小肠IEL数量(p0.05)和IgA分泌细胞的面积(p0.01);L. salivarius B1还能提高仔猪日增重(p0.05)和小肠绒毛高度(p0.05) 3. L. salivarius B1在仔猪肠道的定植情况及其对肠道菌群的影响 L. salivarius B1饲喂新生仔猪后能够促进小肠发育和增加肠道免疫细胞数量。为进一步研究L. salivarius B1在体内的作用机制,本试验对L. salivarius B1饲喂后在仔猪体内的定植及对肠道菌群组成的影响进行了研究。给新生仔猪饲喂L. salivarius B1后分别于7、14、21日龄采取仔猪新鲜粪便,28日龄每窝随机挑选2头(每组4头)仔猪宰杀,取肠黏膜。采用DGGE方法分析L. salivarius B1在体内的定植情况,利用Real-time PCR技术对肠黏膜中L. salivarius数量进行分析;用传统的活菌计数方法对几种主要的肠道菌计数。结果表明:L. salivarius能够在仔猪哺乳后期自然出现;DGGE图谱显示饲喂L. salivarius B1的7日龄仔猪粪便中出现该菌株相应的条带;在饲喂L. salivarius B1的28日龄仔猪肠黏膜中,L. salivarius,总数显著高于其它组(p0.05);7日龄的仔猪粪便和28日龄仔猪肠黏膜中双歧杆菌数量为乳酸杆菌组明显高于对照组(p0.05);但对大肠杆菌和肠球菌等肠道菌数量没有明显的影响。本试验结果说明L. salivarius B1饲喂新生仔猪后能够有效地定植于仔猪体内,并且能够增加哺乳前期仔猪粪便和十二指肠局部黏膜双歧杆菌的数量。 4. L. salivarius B1早期定植对仔猪肠道β-防御素2和细胞因子分泌的影响 新生仔猪肠道细胞能够分泌抗菌肽参与天然免疫反应,β-防御素(pBD-2)是抗菌肽中重要的一种,在仔猪先天性免疫中起着非常重要的作用。给新生仔猪饲喂L. salivarius B1后于7、14、21、28日龄采取仔猪唾液,28日龄每窝随机挑选2头(每组4头)仔猪宰杀取黏膜。应用Real-time PCR方法检测肠黏膜中pBD-2及细胞因子IL-1p、TNF-α和IL-6基因的表达水平,用ELISA方法对不同日龄仔猪唾液中的pBD-2含量进行测定。结果显示:L. salivarius B1早期定植能使十二指肠黏膜pBD-2基因表达水平及含量显著升高(p0.01);仔猪唾液中pBD-2的含量随日龄有不同程度的增加,其中在14,28日龄时乳酸杆菌组仔猪唾液中的pBD-2含量极显著增加(p0.05)。L. salivarius B1早期定植还对回肠IL-6基因表达有明显的促进作用(p0.05)。本试验的结果表明L. salivarius B1早期定植能够促进肠黏膜细胞功能基因的表达,提高小肠局部黏膜免疫的防御水平。 5. L. salivarius B1早期定植对肠道TLR表达的影响 Toll样受体(TLRs)是一类主要表达于天然免疫细胞表面的模式识别受体,通过识别与结合相应的配体启动宿主天然抗感染免疫。目前,研究发现哺乳动物体内存在12种TLRs, TLR2主要对革兰氏阳性细菌细胞壁成分进行识别,而TLR9主要识别细菌DNA中非甲基化的CpG基序。本试验主要从基因和蛋白水平研究L.salivariusB1对仔猪小肠TLR2和TLR9表达水平的影响。给新生仔猪饲喂L. salivarius B1后,28日龄每组随机挑选4头仔猪宰杀取肠黏膜,分别应用Real-time PCR方法和Western-Blot方法测定十二指肠和回肠中TLR2和TLR9的基因表达水平和蛋白表达水平。试验结果显示:L.salivariusB1能够显著地增强十二指肠和回肠中的TLR2的基因和蛋白表达(p0.05),而对TLR9表达基因和蛋白水平均无明显的影响。 6. L. salivarius B1对仔猪抵抗E. coli K88感染的影响 为进一步探导L. salivarius B1定植后对肠道病原菌的抗感染作用,本试验研究了L. salivarius B1对仔猪抵抗E. coli K88感染的影响。对前期试验中三组仔猪宰杀后余下的仔猪28日龄断奶后的腹泻情况观察一周,35日龄时所有仔猪接种相同剂量的大肠杆菌菌液(E. coli K88,活菌数为108cfu/ml,接种量为2 mL/只),观察仔猪对E. coli K88感染的抵抗能力,并对仔猪肠黏膜受损情况及细胞因子IL-6、TNF-a和IL-1p基因表达进行测定。结果表明:早期接种L. salivarius B1的仔猪腹泻指数明显低于对照组(p0.05)且康复较快;肠黏膜的IL-61比未接种L.salivarius B1的仔猪高(p0.05),而炎性因子TNF-α则较低(p0.05);回肠肠绒毛受损程度也较轻。说明早期L. salivarius B1勺定植提高了仔猪天然免疫功能,增强仔猪断奶期对病原菌感染的抵抗力,有助于仔猪健康生长。


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