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小菜蛾GABA受体基因克隆及棉铃虫羧酸酯酶的功能表达

袁国瑞  
【摘要】:该博士论文为本人硕博连读期间所做内容,总体分为两部分,其中“小菜蛾GABA受体基因克隆”部分的内容主要在硕士阶段完成,“棉铃虫羧酸酯酶的功能表达”部分的内容由国家留学基金委联合培养博士生项目资助在澳大利亚CSIRO昆虫所完成。 1.小菜蛾GABA受体基因cDNA全长的克隆及序列分析 采用RT-PCR和RACE技术从小菜蛾中克隆得到GABA受体两个亚基基因,即PxGABARal和PxGABARa2。PxGABARal的cDNA编码区长1458bp,编码485个氨基酸;PxGABARa2的cDNA编码区长1563bp,编码520个氨基酸。两个亚基均含有保守的四个跨膜区及半胱氨酸桥。黑腹果蝇Rdl基因直系同源A302S突变位点处,PxGABARal为A282, PxGABARa2为S285。分别对两亚基的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST同源性搜索,发现PxGABARal与其它GABA受体a亚基显示了较高的相似性:烟芽夜蛾a3亚基(AF006192,95%),烟芽夜蛾的α2亚基(AJ224513,85%)、黑腹果蝇Rdl亚基(AAF50311,84%)、小菜蛾α2亚基(FJ665610,83%)、家蚕α亚基(EF521821,81%)。PxGABARa2与其它GABA受体α亚基一致性为:烟芽夜蛾α2亚基(AJ224513,91%)、甜菜夜蛾α2亚基(ABQ45398,87%)、家蚕α亚基(EF521821,84%)、烟芽夜蛾的α3亚基(AF006192,83%)、黑腹果蝇Rdl亚基(AAF50311,77%)。两亚基在第三外显子都存在两种可变剪接形式,在第六外显子均为同一种剪接形式。 2.小菜蛾GABA受体亚基基因组结构及其基因定位 在已知小菜蛾PxGABARal和PxGABARa2基因cDNA序列的基础上设计引物,利用染色体步移及常规PCR技术扩增得到小菜蛾PxGABARal和PxGABARa2除第一内含子外的基因组序列,两基因均包含9个内含子,内含子-外显子边界符合GT-AG规则,内含子插入位点相同,且内含子相高度一致,表明这两个基因可能起源于近期的基因复制事件。为了确定两个基因是否位于Z染色体上,分别采用两种分子标记对SZ-Diel品系雌性(zSerw)和ROTH品系雄性小菜蛾(ZAlaZAla)单对杂交F1代进行了基因型检测。对于PxGABARa1,66个杂交F1代个体中,33个雌性个体为A282半合子,33个雄性个体为A/S282杂合子,这表明PxGABARa1位于Z染色体;对于小菜蛾PxGABARa2,34个杂交F1代个体中,15个雌性个体均只有一条长的条带,与父本(ROTH)一致;19个雄性个体均同时有长、短两条条带,一个来自父本(ROTH)另外一个来自母本(SZ-Diel),证明了小菜蛾AGABARa2基因也位于Z染色体上。 3.小菜蛾PxGABARa1亚基A282S突变与狄氏剂及氟虫腈抗性关系 为了明确小菜蛾PxGABARa1亚基A282S在狄氏剂及氟虫腈抗性中的作用,通过单对杂交分别建立了含有A282S突变纯合子的氟虫腈抗性品系SZ-Fser及狄氏剂抗性品系SZ-DielSer,并建立小菜蛾氟虫腈抗性近等基因系SZ-FAla。SZ-FSer相对与洛桑敏感品系ROTH和深圳对照品系SZ,对氟虫腈抗性倍数分别为208.43和182.75倍;对狄氏剂、硫丹、林丹有低水平的交互抗性,抗性倍数分别为6.4、1.89和5.81,对阿维菌素和多杀菌素没有交互抗性。SZ-DielSer相对于洛桑敏感品系ROTH和深圳对照品系SZ对狄氏剂分别有9.3和6.52倍的抗性;对氟虫腈、硫丹、林丹有低水平的交互抗性,抗性倍数分别为10.91、6.07和8.95,对阿维菌素及多杀菌素没有交互抗性。SZ-FAla相对于洛桑敏感品系ROTH和深圳对照品系SZ对氟虫腈的抗性分别为101.20和88.73倍,对狄氏剂和硫丹不存在交互抗性。 SZ-FSer、SZ-DielSer及SZ-FAla品系相对于SZ品系对狄氏剂的抗性倍数分别为6.4、6.52和1.34; SZ-FSer、SZ-DielSer(?)目对于SZ-FAla品系对狄氏剂的抗性分别为4.77、4.86倍;SZ-Fser品系相对于SZ-FAla品系对氟虫腈的抗性倍数为2.06,从而表明小菜蛾PxGABARal基因A282S突变是小菜蛾狄氏剂抗性的主要因子,是小菜氟虫腈抗性的次要因子。 鉴定了SZ-Dielser品系与敏感品系ROTH正反交F1代不同药剂处理后存活个体雌、雄虫的基因型,正交F1代雄虫(ZSerZAla)、雌虫(ZAlaW)及反交F1代雄虫(ZSerZAla)、雌虫(ZSerW)的存活比例如下:1.5ppm氟虫腈处理后分别为8.5%、6.5%和9%、10.1%;600ppm狄氏剂处理后分别为6.5%、全部死亡和5%、16.5%;1,500ppm硫丹处理后分别为11%、2.5%和13.5%、15.5%。该结果进一步证明了小菜蛾PxGABARal基因A282S突变是狄氏剂抗性的主要因子,是氟虫腈、硫丹抗性的次要因子,同时也证明小菜蛾狄氏剂抗性与Z染色体连锁。 4.棉铃虫羧酸酯酶基因在昆虫细胞中的异源表达 利用Gateway技术将棉铃虫YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001c、CCE001d、CCE001i、CCE001j重组至入门载体,获得入门克隆。对两个品系中的五个基因氨基酸序列分析表明,均具有保守的胱氨酸环、氧负离子孔(GG)及由Ser、G1u和His构成的催化三联体,多个位点存在氨基酸多态性;与铜绿丽蝇(L. cuprina)aE7基因E3的G137等同位点没有G137D突变,E3 W251等同位点处,CCE001c及CCE001i在YG和YGF品系里均是L,与铜绿丽蝇E3该位点突变型相同。CCE001i在YG品系中靠近C端有四个氨基酸的插入。重组病毒成功转染昆虫Sf9细胞,羧酸酯酶活性初步检测显示,除YG品系中的CCE001i外,其余均检测到了活性。利用荧光定量PCR测定了各重组病毒滴度,在昆虫细胞中对来自YG和YGF品系的羧酸酯酶CCE001a、CCE001、CCE001d、CCE001i、CCE001j进行了异源表达。 5.棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白有机磷水解活性及羧酸酯酶活性的测定 以荧光化合物dEUP和dMUP对棉铃虫羧酸酯酶重组酶蛋白有机磷水解活性及其摩尔浓度进行了测定。棉铃虫所有羧酸酯酶重组蛋白有机磷水解活性,没有出现像E3突变后有机磷活性显著升高的情况。相对于E3 WT,仅部分棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白的有机磷活性升高。001d对dEUP和dMUP的kcat值比较接近,而001a、001c、00li、001j则更偏向于水解dMUP,其kccat值为dEUP的1.8到4.6倍,这种偏好于水解dMUP的特性与铜绿丽蝇E3 W251L相似,001c和001i在两品系中E3 W251L等同位点为L,而001a、001j则为F。从而表明,该位点为L并不是造成这种偏向性的必要条件。 棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对-NA有较p-NPA高的底物特异性。001a、001j、001d对a-NA有着较高催化活性的,其与E3 W251L等同位点为F;001c、001i催化活性较低,与E3 W251L等同位点为L,因此,棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白a-NA水解活性的差异可能与该位点氨基酸差异相关。001a、001j对α-NA的催化效率在两品系间差异不显著,001c、001d在两品系间差异显著,YGF品系约为YG品系的2倍和1.5倍。001c、001j对p-NPA催化效率在两品系中差异显著。001a、001d、001j对a-NA的底物亲和性相对较高,由此推测,001a、001d、001j较高的底物亲和特性可能通过对拟除虫菊酯的阻隔作用在抗性中发挥作用。 6.棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对拟除虫菊酯及其荧光类似物的代谢 为了了解棉铃虫羧酸酯酶对拟除虫菊酯水解活性,本研究分别测定了棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对氯氰菊酯、氰戊菊酯及其荧光类似物各异构体的水解活性。棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对氯氰菊酯及氰戊菊酯荧光类似物各异构体的活性测定表明:对氯氰菊酯各立体异构体的水解活性存在立体选择性,即:transcis、1(S)1(R)。总的来看,对1(S)trans-a(S)和1(R)trans-a(R)的活性最高,对其异构体它异构体活性相对较低甚至检测不到。对氰戊菊酯各立体异构体优先水解酸基团为2R构型的异构体,与E3 WT相比,001a、001d、001j对各异构体水解活性有明显升高,001c仅对个别异构体有较低的活性。棉铃虫羧酸酯酶重组蛋白对氯氰菊酯各异构体及顺式氰戊菊酯的活性测定表明:对氯氰菊酯各异构体的水解具有与对其荧光类似物水解相同的立体选择性,同样对1(S)trans-α(S)和1(R)trans-α(R)的活性最高,但对其它异构体的活性有所升高。同时,各重组蛋白均能不同程度的水解顺式氰戊菊酯,在0.3-5.39pmol/min/pmol之间。上述结果表明,棉铃虫羧酸酯酶对拟除虫菊酯具有水解代谢活性,作者认为,具有拟除虫菊酯代谢活性的棉铃虫羧酸酯酶的mRNA过量表达在其抗性中起着重要作用。


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