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玉米(Zea mays L.)NADPH氧化酶基因克隆、表达特性及功能研究

林凡  
【摘要】:植物NADPH氧化酶又称为呼吸爆发氧化酶同源蛋白(respiratory burst oxidase homolog, RBOH)是一类以胞质中的NADPH为电子供体,将氧催化生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)的氧化酶。近年来研究发现:作为一个多基因家族,不同的rboh基因成员存在组织分布、基因表达和活性调控模式的差异,执行着不同的功能。从不同植物中克隆新的rboh基因将有助于更多的了解其功能及活性调控的信息。然而,植物中rboh基因的研究主要集中在双子叶模式植物,关于重要作物玉米rboh基因的研究尚无报道。另一方面,植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物生长发育过程和对各种环境胁迫的反应中起重要作用,其作用模式与植物细胞中的氧化胁迫有关。ABA可引起ROS的产生,提高植物抗氧化防护能力。NADPH氧化酶抑制剂碘二苯(diphenylene iodioium, DPI)敏感性ROS被证明在ABA诱导的抗氧化防护中起重要作用。然而,有关ABA诱导抗氧化防护的详细机制仍有待阐明。 因此,本研究以玉米叶片为材料,对玉米NADPH氧化酶进行了基因克隆、序列分析、表达特性及其与ABA诱导的抗氧化防护途径之间的关系进行了研究。主要结果如下: 利用同源序列设计引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法,以及利用不断增加的玉米基因组数据库进行电子克隆为辅助,从ABA处理的玉米幼苗叶片中克隆了4种Zmrboh基因,命名为ZmrbohA、B、C和D。序列分析显示它们存在典型的RBOH分子特征,包括调节活性的N端EF手性区域、保守的6个跨膜区(TMD1-6)、在催化活性中起关键作用的C端FAD和NADPH结合位点。其中ZmrbohB、C可能是来自于同一祖先的重复基因。同时检测了4种Zmrboh基因的组织分布,发现这些基因在所检测的各种组织中都有表达,但具有不同的表达模式。 可变剪切(alternative splicing, AS)是一种重要的转录后基因调控机制。通过RT-PCR分析,发现玉米ZmrbohB和D基因具有可变剪切现象,至少各存在2种不同的可变剪切体。其中ZmrbohB-β是在ZmrbohB编码区中保留了内含子11的产物,可能是无意义密码子介导的mRNA降解途径的靶标。在所检测的各种器官中,ZmrbohB基因的2种可变剪切体(ZmrbohB-α和-β)都有表达,但ZmrbohB-α是主要转录本,并且一些胁迫条件(盐离子、低温、高温、紫外辐射、ABA)的刺激能提高主要转录本ZmrbohB-α的相对含量。这提示可变剪切作为一种转录后水平的调节机制,参与了植物NADPH氧化酶活性的调控。ZmrbohD-β是ZmrbohD基因外显子4部分被剪切的产物。它缺失了保守的NADPH氧化酶跨膜区序列,定位于细胞质中。这是首次发现非膜定位的植物RBOH蛋白。 有证据显示在玉米叶片ABA信号转导过程中MAPK的活化和H2O2产生之间存在交叉对话。在此基础上,采用药理学方法和荧光定量RT-PCR技术研究了H2O2、MAPK和NADPH氧化酶基因(Zmrboh)的转录在ABA信号途径之间的关系。ABA处理后,玉米叶片中ZmrbohA-D基因转录水平与对照组相比,出现双阶段快速、瞬时的上调。H2O2清除剂(DMTU和CAT)或MAPKK抑制剂(PD98059和U0126)的预处理能有效抑制ABA诱导的Zmrboh基因阶段Ⅱ的转录,而不影响阶段Ⅰ的变化。此外,H2O2(10 mM)处理也能诱导Zmrboh基因的表达,且受MAPKK抑制剂预处理的抑制。这些结果提示,ABA能诱导Zmrboh基因的转录,该基因转录和H2O2、MAPK之间存在交叉谈话机制;一个与Zmrboh基因转录相关的正放大环路存在于ABA途径中。 玉米是世界上最重要的禾谷类作物之一,也是植物研究的一种模式生物。但目前玉米的遗传转化仍然十分困难,没有一套完整的被广泛使用的转化体系。本研究以8种玉米基因型为材料,对基因型、幼胚大小、培养基激素组成等影响因素进行对比,建立玉米登海11号(DH11)受体系统。而后以DH11的胚性愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌液浓度、侵染时间、筛选方式等因素对玉米转化的影响。研究表明,菌液浓度和侵染时间相互作用是影响转化效果的重要因素。在本研究条件下,菌液浓度OD600=0.6,侵染时间10 min可以获得较理想的转化效率。作为一种商业化品种DH11,这一遗传体系无需花费大量的精力进行繁种,给研究者带来了方便。 在前期研究的基础上,选取ZmrbohB基因为研究对象,根据RNA干涉原理构建了其反向重复序列表达载体,采用农杆菌介导法转入DH11胚性愈伤组织。经PCR和荧光定量RT-PCR检测,初步证明ZmrbohB基因反向重复片段整合到玉米基因组中,并抑制了ZmrbohB基因的表达,获得了该基因表达受抑制的变异体。分析它们对外源ABA处理的反应,结果表明:变异体中H2O2的积累少于未转化的再生植株;同时,ABA诱导的玉米叶片抗氧化防护酶如SOD、CAT、APX和GR总活性的提高在变异体中也受到抑制。这提示ZmrbohB基因参与了ABA诱导抗氧化防护酶活性提高的信号转导途径,是ABA信号途径的一个重要组分。


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