收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化与分子机理

龚佑静  
【摘要】:化学农药的广泛使用对农业发展和粮食安全起了重要作用,但是由于害虫抗药性的发展,防治抗药性害虫正变得越来越困难。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)由于其杀虫晶体蛋白(ICPs)具有高度专一性,对人畜和非靶标昆虫非常安全而被广泛用于防治小菜蛾等鳞翅目害虫。小菜蛾Plutella xvlostella是一种全球性分布的蔬菜害虫,早在1990年就有田间小菜蛾种群对Bt制剂产生抗性的报道,但迄今为止,小菜蛾对Bt抗性的分子机理还是没有研究清楚。为了研究我国小菜蛾对Cry1Ac的抗性机理,首先在室内筛选获得一个高抗品系(SZBT),并用F1筛选法检测了3个小菜蛾田间种群Cry1Ac抗性基因的频率;通过蛋白组学方法,对小菜蛾CryAc抗性和敏感品系幼虫中肠毒素结合蛋白进行分离和鉴定,发现一种Bt毒素受体—氨肽酶N蛋白(PxAPN2)在抗性品系中表达量明显低于敏感品系;然后,克隆了小菜蛾PxAPN2基因,并采用RNAi技术明确了PxAPN2基因在小菜蛾对Cry1Ac抗性产生中的作用。明确小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化和分子机理对于小菜蛾Bt抗性治理具有重要意义。 1.小菜蛾Cry1Ac抗性遗传互补与田间种群Cry1Ac抗性基因频率检测 由于Bt制剂的大量使用,我国小菜蛾田间种群对Cry1Ac已产生了不同程度的抗性。由于小菜蛾对Cry1Ac抗性为不完全隐性遗传,检测抗性基因频率对于制定抗性治理措施尤为重要。通过室内筛选获得对Cry1Ac抗性达2000倍左右的SZBT品系,该品系对CrylAc的抗性表现为Ⅰ型(Mode 1)。抗性遗传互补试验表明,SZBT品系与来自美国的Cry1Ac-R抗性品系对Cry1Ac的抗性由相同遗传位点控制。将2008年采自广东广州、惠州及云南玉溪的田间小菜蛾分别于SZBT进行单对杂交,通过检测120个单对杂交后代(F1)在CrylAc区分剂量(2μg/mL)下的死亡率,测得这3个田间种群Cry1Ac抗性基因频率分别为0.375、0.472和0.156。广州、惠州和玉溪田间种群对Cry1Ac的抗性分别为73、117和13倍,抗性程度与其抗性基因频率相一致。 2.小菜蛾中肠Cry1Ac结合蛋白的分离与鉴定 用生物素标记的CrylAc分别与敏感品系ROTH、抗性品系SZBT和对照品系SZ小菜蛾4龄幼虫中肠BBMV(用传统的SDS-PAGE分离)进行配基结合试验,发现Cry1Ac结合蛋白有10条主带。小菜蛾SZBT抗性品系110 kDa结合蛋白表达量低于敏感品系,而其他结合蛋白表达量差异不明显。据此推测,110 kDa的Cry1Ac结合蛋白可能为Cry1Ac的功能受体,其表达量下降可能与SZBT品系对Cry1Ac抗性相关。 为了进一步分离和鉴定Cry1Ac结合蛋白,用2-D电泳和配基结合方法对小菜蛾抗性品系(SZBT)和敏感品系(ROTH)中肠BBMV中Cry1Ac结合蛋白进行分离,并通过肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)对主要结合蛋白进行鉴定。鉴定的小菜蛾Cry1Ac结合蛋白包括氨肽酶N(PxAPN2)、储存蛋白(storage protein)、肌动蛋白(actin)、硫酸酯酶(glucosinolate sulfatase)、V-ATPase亚基B (vacuolar ATPase B subunit)等。小菜蛾SZBT抗性品系中PxAPN2表达量明显低于敏感品系的相应结合蛋白,该PxAPN2(分子量为110 kDa)可能即为1-D电泳所发现的在抗性品系中表达量降低的110 kDa结合蛋白。氨肽酶N是鳞翅目昆虫中肠BBMV上Cry1Ac毒素的重要受体,小菜蛾PxAPN2蛋白的表达量降低可能与抗性品系Cry1Ac抗性相关。 3.小菜蛾PxAPN2基因沉默后对Cry1Ac敏感性的影响 采用RT-PCR技术分别克隆了抗性(SZBT)和敏感(ROTH)品系中编码110kDaCry1Ac结合蛋白的氨肽酶N基因(PxAPN2)。抗性和敏感品系PxAPN2基因间有多个位点的氨基酸发生替换。用实时定量PCR比较PxAPN2基因在小菜蛾SZBT和ROTH品系四龄幼虫中肠中的mRNA表达量,发现SZBT抗性品系PxAPN2 mRNA表达量下降为ROTH敏感品系的33.9%。 为了证明小菜蛾PxAPN2在CryAc抗性形成中的作用,采用RNAi技术使PxAPN2基因mRNA表达下调,研究PxAPN2下调能否使小菜蛾敏感品系对Cry1Ac获得抗性。通过喂食体外合成的PxAPN2 dsRNA干扰小菜蛾ROTH敏感品系PxAPN2基因的表达,结果表明喂食PxAPN2 dsRNA最高可以使PxAPN2基因mRNA表达量下降53%,而另一种氨肽酶N基因(APNA) mRNA表达量则没有明显变化。小菜蛾PxAPN2基因被沉默后使ROTH敏感品系幼虫对Cry1Ac产生4-14倍抗性。上述结果表明,小菜蛾PxAPN2是Cry1Ac的功能受体,其表达量降低导致小菜蛾对CryAc产生抗性。 本研究运用蛋白组学、配基结合、基因克隆和基因沉默等技术,系统研究了小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化和分子机理,证明了PxAPN2为小菜蛾幼虫中肠中Cry1Ac的功能受体,该受体mRNA和蛋白表达量下降能够导致小菜蛾对Cry1Ac产生高水平抗性。由于该基因位点与Cry1Ac抗性基因并不位于同一连锁群,PxAPN2 mRNA表达下调可能与反式作用因子有关,PxAPN2蛋白表达量下降也可能与转录后调控有关,确切原因还有待进一步研究。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 周林松;几种杀虫剂防治甘蓝菜小菜蛾试验初报[J];内蒙古农业科技;2004年S2期
2 戴志聪;;OMI-88防治花菜小菜蛾的药效试验[J];福建农业科技;2006年01期
3 陆晓莉;王依明;张家驯;;几种新农药防治甘蓝小菜蛾试验[J];上海蔬菜;2006年06期
4 劳赛国;;27%丁醚脲·高氯防治小菜蛾田间试验[J];广西热带农业;2009年05期
5 李容宇;;防治油菜害虫[J];新农业;1975年09期
6 柯礼道;方菊莲;;小菜蛾生物学研究——生活习性的观察[J];植物保护学报;1980年03期
7 徐肇坤,张雄飞;小菜蛾生活习性的研究[J];湖南农业科学;1984年04期
8 何复梅;郑志东;黄秉资;;小菜蛾性信息素田间应用研究[J];昆虫天敌;1988年04期
9 武美云;;用性信息诱杀小菜蛾[J];现代农业;1989年06期
10 张原,吴冰玉,陈先雄,李斌;特异性昆虫生长调节剂防治抗性小菜蛾试验[J];湖北植保;1994年05期
11 薛榕,朱应,李广宏;AcNPV、PxGV单感染及混合感染对小菜蛾的影响[J];自然杂志;1995年05期
12 卢元华;Bt_(82612)防治菜青虫、小菜蛾效果好[J];北京农业;1995年12期
13 关雄,黄志鹏,彭建立,陈少伟,邱思鑫;不同种类杀虫剂对甜菜夜蛾和小菜蛾的药效测定[J];福建农业大学学报;1996年02期
14 李云寿,罗万春,慕立义,赵善欢;敌敌畏对不同寄主植物上小菜蛾羧酸酯酶活性的体内抑制[J];华东昆虫学报;1997年02期
15 陈泽坦,金启安;威敌Ⅱ型可湿性粉剂防治蔬菜小菜蛾试验[J];热带农业科学;1997年01期
16 杜晓芸,杜志斌,李炳成;内蒙古乌盟地区小菜蛾的防治[J];现代农业;2000年05期
17 刘奎,符悦冠,彭正强,金启安;几种生物农药防治小菜蛾药效试验[J];农药;2001年11期
18 张志勇,张翠英;防治菜青虫、小菜蛾经验[J];河北农业;2001年06期
19 杨广,尤民生;小菜蛾对蔬菜气味的定向行为[J];武夷科学;2002年00期
20 孙强,路浩,陈建卓;小菜蛾在春油菜生育历期及田间种群动态初探[J];黑龙江农业科学;2003年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张鹏飞;孟琳琳;王进忠;张志勇;张民照;;蛇床子素对小菜蛾的生物活性及对虫体内解毒酶活性的影响[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
2 陆增法;沈淑平;陈守坚;罗广宁;;利用HD-1制剂防治小菜蛾的研究[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
3 吴伟坚;;小菜蛾对寄主的选择性及机制[A];昆虫与环境——中国昆虫学会2001年学术年会论文集[C];2001年
4 孟晓云;张月英;;小菜蛾性信息素田间活性[A];北京昆虫学会成立四十周年学术讨论会论文摘要汇编[C];1990年
5 李广宏;朱应;蔡汪洋;孟小林;梁东瑞;;Vc、胆碱对小菜蛾产卵的影响[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
6 侯有明;尤民生;;非嗜食植物次生物在小菜蛾生态控制中的应用[A];中国青年农业科学学术年报[C];2002年
7 蒋继宏;吴薇;黄小花;王秀琴;;苦豆碱对小莱蛾体内保护酶系统活力的影响[A];第二届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会论文集[C];2003年
8 冯夏;帅应垣;陈焕瑜;;小菜蛾对Bt的抗药性及其治理技术研究[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
9 敖成光;王金良;姜伟锋;沈王生;;小菜蛾发生原因和防治技术[A];昆虫学创新与发展——中国昆虫学会2002年学术年会论文集[C];2002年
10 王音;问锦曾;雷仲仁;;中国小菜蛾变形孢虫研究初报[A];中国原生动物学学会第十一次学术讨论会论文摘要汇编[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨广;十字花科蔬菜——小菜蛾——小菜蛾绒茧峰之间的相互作用[D];福建农林大学;2001年
2 符伟;小菜蛾对Bt抗性机理及湖南地区综合治理研究[D];湖南农业大学;2013年
3 孙丽娜;小菜蛾和甜菜夜蛾鱼尼丁受体基因克隆及分子药理学研究[D];中国农业科学院;2012年
4 龚佑静;小菜蛾对Bt毒素Cry1Ac抗性的生化与分子机理[D];南京农业大学;2010年
5 雷妍圆;小菜蛾对BT毒素蛋白CrylAc抗性相关基因的筛选[D];中国农业科学院;2012年
6 王兴亮;小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征及机理[D];南京农业大学;2012年
7 魏辉;植物次生物质对小菜蛾控制作用的研究[D];福建农林大学;2002年
8 王音;绿僵菌LD65和LF68菌株生物学特性及对小菜蛾的致病机理[D];中国农业大学;2005年
9 杨峰山;抗Bt小菜蛾的选育、受体基因克隆及PTD对Cry1Ac的增效作用[D];中国农业大学;2004年
10 曹广春;小菜蛾Plutella xylostella (L.)对虫酰肼的抗性及其机理研究[D];南京农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 苏旭;苍耳次生物质对小菜蛾的产卵忌避活性及其化学成分[D];湖南师范大学;2010年
2 李慧冬;Avermectin系列化合物对小菜蛾实验生态毒理学研究[D];山东农业大学;2002年
3 李阿根;小菜蛾对氟虫腈的抗性机理研究[D];南京农业大学;2004年
4 郭莹;小菜蛾对毒死蜱的抗性与饲养温度关系的研究[D];福建农林大学;2004年
5 覃伟权;热带植物次生物质对小菜蛾种群的控制作用[D];华南热带农业大学;2004年
6 何玉仙;小菜蛾对阿维菌素的抗药性研究[D];福建农林大学;2000年
7 刘海涛;小菜蛾主要捕食性天敌捕食功能系统及其助增机理研究[D];扬州大学;2001年
8 吕桂贞;杀虫剂混配对小菜蛾毒力联合作用及生化机理研究[D];华中农业大学;2010年
9 施英利;温州蜜桔桔皮提取物对小菜蛾的生物活性[D];浙江大学;2004年
10 张晓飞;小菜蛾对三种杀虫剂抗药性的遗传基础研究[D];南京师范大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张翕;油菜小菜蛾虫害的防治[N];山西科技报;2004年
2 林勇文 余德亿;小菜蛾综合防治技术[N];福建科技报;2005年
3 陈英侠;小菜蛾的发生与防治[N];河南科技报;2007年
4 山东省枣庄市农业局 翟洪民;蔬菜小菜蛾防治技术[N];河北科技报;2008年
5 左楚才;暖冬谨防油菜小菜蛾[N];农民日报;2004年
6 本报记者;小菜蛾中等偏重发生[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2007年
7 辛集市植保站 周芳;抓紧防治小菜蛾、菜青虫[N];河北科技报;2009年
8 金素英;小菜蛾防治方法[N];河南科技报;2007年
9 北农;蔬菜小菜蛾防治技术[N];河南科技报;2008年
10 冯国明;小菜蛾的生活习性[N];陕西科技报;2009年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978