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氯氰菊酯降解菌株的筛选、鉴定、降解机制及应用研究

张隽  
【摘要】:拟除虫菊酯(以下简称菊酯)是人工合成的一类高效、广谱、神经致毒性杀虫剂,被广泛应有于农业病虫害的防治和家庭卫生害虫的杀灭。作为高毒、难降解的有机磷和有机氯农药替代品,菊酯类除草剂在世界范围内得到广泛应用,目前菊酯类杀虫剂占我国农业杀虫剂使用面积的三分之一以上。 相对有机磷和有机氯农药,菊酯类杀虫剂对哺乳动物低毒,环境危害较低。但最近的研究表明该类杀虫剂对哺乳动物的神经、生殖、免疫、内分泌和心血管系统等仍有明显的毒副作用;此外,菊酯类杀虫剂对蜜蜂、鱼类和水生无脊椎动物等非靶标性生物高毒,比如对鱼的急性毒性浓度一般在μg/L级。 菊酯类杀虫剂在环境中的残留和降解越来越成为关注的焦点。以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物消除技术。本研究拟从拟除虫菊酯杀虫剂降解菌的分离筛选入手,同时研究其降解途径,通过易错PCR技术对菊酯水解酶进行体外定向进化,获得比酶活大幅提高的突变酶,解决了常规菌株难以降解联苯菊酯的问题。 一、氯氰菊酯杀虫剂降解菌的分离和鉴定 从生产菊酯杀虫剂的废水处理系统中分离到三株新菌株,分别命名为LQY-7T、LQY-18T和BA-3T。利用多相分类学技术对这三株菌的分类学地位进行了研究。 菌株LQY-7T革兰氏染色阴性,菌体杆状,无鞭毛,无芽孢;菌落颜色为黄色,圆形并向上凸起,边缘光滑,直径2-4mm,并且粘着于平板上;细胞内无非扩散性黄色素。好氧,化能异养型。该菌株的呼吸醌为MK-6和MK-7;主要的脂肪酸为iso-C15:0, iso-C15:1 G, iso-C17:0 3-OH, anteiso-C15:0和iso-C15:0 3-OH; DNAG+C含量为34 mol%,将菌株LQY-7鉴定为Flavobacterium属的一个新种,命名为Flavobacterium haoranii sp. nov.。 LQY-18T革兰氏染色反应呈阴性,无鞭毛,无芽孢,在TSA琼脂培养基上能够形成的黄色、表面凸起、光滑湿润,有边缘规则的菌落;主要的呼吸醌为MK-7;主要的脂肪酸为summed feature 3 (C16:1ω6c and/or C6:1cω7c), iso-C15:0和iso-C17:0 3-OH);包含磷脂酰乙醇胺,鞘脂,未知氨基磷脂,未知氨基脂,未知脂;DNA G+C含量为40.3 mol%。通过以上多相分类结果和16S rRNA基因序列相似性分析结果,将LQY-18鉴定为鞘氨醇杆菌属的一个新种,命名为Sphingobacterium wenxiniae sp. nov.。 菌株BA-3T革兰氏染色反应呈阴性,无芽孢,杆状,无鞭毛,在MLB固体培养基上茵落呈灰白色、圆形、边缘规整、突起、不透明、质地均匀,严格好氧;主要的脂肪酸是C16:0、C14:02 -OH和Summed feature 8 (C18:1ω6c and/or C18:1ω7c);所含极性酯主要为乙醇酸磷酯、磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和神经鞘糖脂类和鞘糖脂;主要的醌是Q-10,主要的多胺是亚精胺;G+C含量为63.8 mol%。因此根据表型及多相分类特征、16S rRNA系统发育和DNA-DNA杂交分析,将菌株BA-3鉴定为鞘脂菌属的一个新种,命名为江苏鞘酯菌Sphingobium jiangsuense sp. nov.。 二、菊酯水解酶PytH的定向进化 根据已报道的菊酯水解酶基因序列设计引物,通过PCR从降解菌株JZ-2中克隆到了菊酯水解酶pytH基因,pytH结构基因共有840个碱基,编码280个氨基酸序列。将pytH基因连接到表达质粒载体pET29a上,在E.coli BL21实现了基因的高效表达。通过易错PCR对野生型pytH基因进行随机突变,获得了1个联苯菊酯水解活力增强的突变体LB37。和野生型PytH相比,突变体LB37有2个氨基酸位点发生改变(Y19F,H127R),其水解联苯菊酯的动力学参数kcat和kcat/Km比原始PytH分别提高6和70倍。通过定点突变技术,将野生型PytH的这两个氨基酸突变为相应的突变体LB37氨基酸,获得两个突变体M19(Y19F)和M127(H127R),酶动力学参数的测定结果表明,突变体M19的kcat/Km比原始PytH提高了5.5倍,M127的kcat/Km比原始PytH提高了14倍。 三、菌株JZ-2对3-苯氧基苯甲酸的代谢途径研究 菌株JZ-2以3-PBA为唯一碳源生长时,能够在24小时内完全降解100 mg·L-13-PBA;利用MS/MS技术检测了该菌株降解3-PBA的代谢产物,并检测了相关降解酶的酶活,结果表明3-PBA在3-苯氧基苯甲酸1,2双加氧酶的作用下断裂醚键生成邻苯二酚和间羟基苯甲酸,邻苯二酚经1,2-双加氧酶作用开环降解,而间羟基苯甲酸不能进一步降解。这是一条不同于国内外已有报道的3-PBA微生物降解代谢新途径。 用MEGA分析软件将已报道的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因进行了同源性比对,选择高保守区域设计兼并引物,以菌株JZ-2基因组DNA为模板成功扩增出约400bp的特异性条带,通过在GeneBank上进行核酸和蛋白质序列比对,发现该片段与咔唑降解菌Sphingomonas sp. KA1 plasmid pCAR3邻苯二酚1,2-双加氧酶(GeneBank Aeeession No. AB270530)同源性为98%,将catA基因的一个片段克隆至自杀性质粒pJQ200SK,转化至E. coli DH5αλpir中获得同源重组载体pJQ-catA,通过三亲接合转入JZ-2中,通过同源重组单交换将pJQ200SK插入catA基因获得突变子JZ-2-△catA.JZ-2-△catA失去了降解邻苯二酚的功能,并且由于邻苯二酚的反馈抑制使3-PBA降解速率下降,24h降解率约为30%,并且突变株不能在含有3-PBA的无机盐平板上生长,进一步证明了3-PBA是经过邻苯二酚的代谢过程被完全降解。 采用以sacB基因为反向筛选标记的同源重组载体,将3-HBA降解基因mbhDHIM整合到Sphingobium faniae JZ-2T的染色体上,构建了遗传稳定、不含外源抗性基因的可以完全矿化3-PBA的工程菌株JZ-2-mbhDHIM。 四、降解菌剂对菊酯污染的植株修复技术应用 应用菊酯农药降解菌剂进行了浙江丽水茶叶的菊酯污染修复研究,通过试验发现降解菌的降解效果与菌剂用量成正相关,降解菌剂对不同类菊酯的降解效果有显著差异,适量的降解菌剂对甲氰菊酯、氯氟氰菊酯有较好的降解效果,对溴氰菊酯降解效果较差。降解菌剂对甲氰菊酯、氯氟氰菊酯3d后降解率达60%以上,7d后降解率达70%以上,而对溴氰菊酯3d后降解率只有32.26%,7d后降解率56.21%,降解菌的使用时间以药后1d傍晚处理效果最好。


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