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ABA诱导的玉米(Zea mays L.)MAPK基因克隆、表达分析、定位及功能研究

王金香  
【摘要】:在植物生长过程中,脱落酸(ABA)是一种重要的调节因子。从脱落酸的产生到激发生理反应要经过一系列相互紧密联系的级联环节。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞生命活动的许多过程中都起着重要的调节作用,并在细胞信号转导中处于核心地位。促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)是真核细胞中普遍存在的信号组分,由逆境胁迫、细胞因子、植物激素、生长因子等诱导,并在植物信号中发挥重要的作用。因此,揭示脱落酸信号转导过程中相关MAPK的生理功能具有重要科学意义。 本实验室前期研究发现,ABA能诱导玉米46 kD MAPK的激活。为了对46 kDMAPK进行身份的鉴定和分析它在ABA信号中的功能,我们以ABA处理的玉米(Zea mays L.,cv.Nongda 108)幼苗的RNA为模板,根据MAPK的保守序列及部分纯化蛋白的氨基酸片段,设计合成简并引物,通过RT-PCR方法克隆了两条中间保守区序列。两对简并引物分别是CGCYTAYGGVATCGTYTGCTC和GTDACVACRTAYTCMGTCAT(对应于MAPK的保守区域GAYGIVCS和MTEYVVTRW),AARATHGCNAANGCNTTYGA和GTDACVACRTAYTCMGTCAT(对应于p46MAPK纯化蛋白的肽段KIANAFD和MTEYVVTRW)。经过DNA序列测定和NCBI Blast在线分析,两条序列都与MAPK基因有很高的同源性。利用RACE和RT-PCR的方法进一步克隆了两条MAPK基因的全长cDNA:ZmMPK3(GenBank登录号:EU130900),基因全长1520 bp,编码区长1131 bp,经过软件分析,ZmMPK3基因编码376个氨基酸组成的多肽,推测分子量是43.5 kD,其氨基酸序列和水稻OsBIMKl.玉米ZmMPK4.拟南芥AtMPK3分别有87.5%、85.5%和70.7%的同源性;第二条基因为p46MAPK基因既ZmMPK5基因,基因编码区全长1200 bp,编码399个氨基酸多肽,ZmMPK5基因编码的氨基酸序列与烟草NtSIPK同源性最高为85.5%、其次是AtMPK6同源性为84%。两种基因具有典型的MAPK特征:含有一个ATP结合位点、11个相对保守的区域、一个催化环、一个TEY的磷酸化基序和一个CD结构域。两种MAPK都属于A类MAPK。 为了进一步对其功能进行研究,通过RT-PCR方法,从玉米幼苗总RNA中扩增ZmMPK3和ZmMPK5完整的基因编码区。利用DNA重组技术,将两个目的基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了全长基因的原核表达载体pGEX-ZmMPK3/ZmMPK5.将原核表达载体转化大肠杆菌BL-21菌株,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达SDS-PAGE电泳发现,带有目的基因的菌体表达出了分子量约71 kD的GST-MAPK融合蛋白。可溶性分析结果表明,GST-ZmMPK3融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中,而GST-ZmMPK5以可溶的形式存在于上清中。用激酶溶液测活的方法分析表明体外表达的两种MAPK都没有激酶活性。选取两个MAPK的特异性片段制备抗体,证明ZmMPK3c抗体、ZmMPK5c抗体分别对ZmMPK3、ZmMPK5具有免疫的专一性。 用半定量及定量RT-PCR方法和免疫共沉淀凝胶激酶(IP)分析表明,ABA和H202诱导的p46MAPK就是ZmMPK5。4种信号分子(ABA、ETH、SA及H202)和多种环境胁迫因子在不同程度上对两种MAPK从转录水平和激酶水平上产生调控作用。其中IP实验表明,ABA和H202都能诱导ZmMPK3、ZmMPK5的激活。 利用基因重组技术,将两种MAPK全长基因插入到植物瞬间表达载体pXZP008上,将表达载体用PEG融合法转化玉米原生质体,以增强型黄色荧光蛋白YFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜观察蛋白在细胞中的定位。结果表明:ZmMPK3主要定位于细胞核,还有少量存在于细胞质中,可以清晰显示细胞骨架的结构;ZmMPK5主要定位于细胞核,另外也有少量定位于细胞质和细胞膜上。将重组质粒pXZMPK3转化玉米原生质体,进行ZmMPK3过表达实验,检测ZmMPK3对原生质体抗氧化基因的表达和抗氧化酶活性的影响,对ZmMPK3进行功能分析。结果表明ZmMPK3过表达对CAT1基因转录没有影响,但上调了细胞中SOD4、cAPX基因表达,同时提高SOD和cAPX酶的活性。因此在"ABA-MAPK-抗氧化反应”信号途径上ZmMPK3参与了ABA诱导的玉米叶片中的抗氧化防护反应。


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