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拟南芥NADPH氧化酶(D和F型)与磷脂酸相互作用及其在ABA信号转导中的关系研究

朱会英  
【摘要】:植物激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)是一种逆境激素,参与一系列非生物胁迫反应,如干旱、低温、盐胁迫等。ABA也可以调节很多生长发育过程,包括种子发育、休眠和萌发、根的生长、开花等。在ABA诱导气孔关闭过程中,NADPH氧化酶起着重要的作用。植物中的NADPH氧化酶,被称作RBOH (Respiratory Burst Oxidase Homolog)。拟南芥中,存在10个编码NADPH氧化酶的基因,从AtrbohA到AtrbohJ。研究证明AtrbohD和AtrbohF是拟南芥保卫细胞中表达的主要NADPH氧化酶基因。AtrbohD和AtrbohF是保卫细胞中产生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的主要来源,对于ABA诱导的ROS含量升高和气孔关闭是必需的。我们前期的研究表明,拟南芥磷脂酶Dα1 (Phospholipase Dα1, PLDα1)参与气孔开闭调节。但是,PLDα1是否参与ABA诱导ROS产生?PLDα1水解产物磷脂酸(Phosphatidic Acid, PA)能否激活NADPH氧化酶活性产生ROS从而促进气孔关闭?PLDα1及PA是否通过调控AtrbohD和AtrbohF来介导ROS产生和气孔关闭?这些问题尚未见研究报道。 本文采用分子生物学、细胞生物学和植物生理学等方法,就PLDα1及PA有无及如何直接调控AtrbohD和AtrbohF进行了研究,并初步探讨了PLDα1、PA、AtrbohD (AtrbohF)三者在ABA诱导保卫细胞ROS产生、气孔关闭过程中的相互作用。主要结果如下: 我们以拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Columbia)为材料,克隆了AtrbohD和AtrbohF基因全长cDNA序列、5’端片段和3’端片段。构建了带有His (Histidine)标签的pET-28a原核表达载体,并且在大肠杆菌中表达了AtrbohD和AtrbohF全长及片段蛋白。通过重组蛋白与磷脂结合的体外实验,初步证明了AtrbohD和AtrbohF的N端片段与PA结合,且不与磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、二酰甘油(DAG)或磷脂酰肌醇磷酸盐类(PI(3)P、PI(4)P、PI(3,4)P)结合。AtrbohD蛋白较AtrbohF结合强烈,各PA分子种与重组蛋白结合情况有所不同,1,2-位脂肪酸均为棕榈酸(di16:0)或硬脂酸(di18:0)的PA不与AtrbohD和AtrbohF结合;而1,2-位脂肪酸为油酸(di18:1) PA、亚油酸(di18:2) PA、棕榈酸和油酸(16:0-18:1)PA、棕榈酸和亚油酸(16:0-18:2)PA、硬脂酸和亚油酸(18:0-18:2)PA及天然PA(来自蛋黄)均与蛋白结合。用酶联免疫法(ELISA)进一步证明16:0-18:2PA与蛋白特异结合。 为了进一步确定PA和AtrbohD (F)结合区域,我们设计了一系列AtrbohD和AtrbohF的截断片段,各截断片段在原核中表达、纯化、并进行Western检测。通过脂肪western印迹(fat western-blot)和脂微囊结合方法(liposome binding assay),我们确定了PA-AtrbohD结合的片段区域在N端的100-330氨基酸之间,PA-AtrbohF结合的片段区域在N端的104-341氨基酸之间。进一步的截断片段表明PA-AtrbohD结合区域在140到160位氨基酸片段。通过点突变实验,证明AtrbohD的(149,150,156,157)精氨酸是PA-AtrbohD结合的主要位点。我们构建了C端融合HA(Hemagglutinin)标签的AtrbohD160 (1-160 aa)、AtrbohD R(149,150,156,157)A、AtrbohF171 (1-171 aa)、AtrbohF AL(156,157)RR,并在保卫细胞原生质体瞬时表达系统表达了这4个蛋白片段,并用荧光标记的PA进行免疫共沉淀,证实R(149,150,156,157)对AtrbohD160 (1-160 aa)的PA结合是重要的。 为了验证PA-Atrbohs结合对保卫细胞气孔调节的生理功能,我们以拟南芥pldα1、atrbohD和atrbohF等突变体为实验材料,研究了在ABA诱导拟南芥气孔关闭过程中,PLDα1、PA和AtrbohD (F)的关系。我们使用WT、atrbohD、atrbohF突变体叶片下表皮为材料,进行气孔开度实验。通过外源施加ABA、16:0-18:2 PA和H2O2,证明PLDα1及PA直接调控着AtrbohD和AtrbohF诱导的气孔关闭过程。用激光共聚焦技术检测了外源施加ABA和16:0-18:2 PA时保卫细胞中ROS的积累情况,表明PLDα1及PA调控着AtrbohD和AtrbohF诱导的ROS升高。 总结,我们发现磷脂酸PA与NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF结合;鉴定了AtrbohD中PA结合区域和关键位点;初步明确了PLDα1和PA作为上游调控因子介导ABA诱导AtrbohD和AtrbohF来源的的ROS积累,进而诱导气孔关闭。为揭示ABA调控气孔运动的信号网路提供了新的依据。


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