收藏本站
收藏 | 论文排版

水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究

李玉蓉  
【摘要】:水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下的两个致病变种之一,引起的水稻细菌性条斑病(条斑病)(Bacterial Leaf Streak, BLS),近年来成为水稻上的重要病害。水稻条斑病菌同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样拥有hrp基因簇,决定着病原细菌在非寄主植物上的过敏反应(hypersensitive response, HR)和在感病寄主上致病性(pathogenicity)。与水稻互作时,水稻条斑病菌的hrp基因簇编码形成Ⅲ型分泌系统(T3SS),将T3SS效应蛋白注入植物细胞中从而导致非寄主产生HR和在水稻上产生细菌性条斑病症状。水稻条斑病菌约27kb的hrp基因簇包括10个hrp,9个hrc (hrp-conserved)和8个hpa (hrp-associated)基因,也称hrp-hrc-hpa基因簇,并由调节因子HrpG和HrpX调控。虽然水稻条斑病菌的hrp-hrc-hpa基因与其它植物病原黄单胞菌中的hrp-hrc-hpa基因有较高的同源性,但每个基因对病原菌的致病性和毒性的贡献并不清楚。本研究以野生菌株RS105为出发菌,利用自杀性载体pKMSl获得了上述29个hrp基因的无标记缺失突变体。植物上接种结果显示,hrc基因突变体全部丧失在非寄主上的HR和在水稻上的致病性(Hrp表型);hpa基因对Hrp表型没有显著影响,仅hpaB和hpa1基因突变体分别丧失和减弱了在水稻上的致病性;hrp基因中,除hrpF表现为毒性显著减弱和仍能激发烟草HR以及hrpE3对Hrp表型没有改变外,其他hrp基因突变后,病原菌均丧失Hrp表型。这些结果为进一步揭示hrp-hrc-hpa基因的具体功能奠定了基础。 为了揭示可能的调控因子对hrp-hrc-hpa基因调控关系,本研究根据其他植物病原黄单胞菌的研究结果,分别对全局性调控因子Trh、LrpX、ColR、ColS和Zur在水稻条斑病菌中的基因进行了敲除。水稻上的致病性和烟草上的HR测定结果显示,trh、lrpX、colR、colS和zur突变体降低了水稻条斑病菌在水稻上的毒性,但不影响在烟草上的HR激发能力。 水稻条斑病菌的hrp基因主要由调节因子HrpG和HrpX进行调控,但至今并不清楚是否HrpG和HrpX调控所有的hpa-hrp-hrc基因转录表达。RT-PCR结果显示,hrcC、hrpD5、hrpE和hpa3基因的转录表达不完全依赖HrpG和HrpX的调控;hrcT受HrpX调控不受HrpG调控,hpa2受HrpG调控不受HrpX调控。另外发现,hrpD6基因突变后,hpa2、hpa1和hpaB基因不转录表达,hrcC和hrcT基因的转录表达水平下降。这说明,HrpG和HrpX通过调控hrpD6的表达而影响了hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的表达。 为了了解其他全局性调控因子以及HrpG和HrpX对上述基因表达的调控作用,本研究将hrpA、hrpB、hrpC、hrpD和hpa3转录单元的启动子以及hrp基因簇中的启动子进行了分析,认为它们的启动子分别为phrcC、phrcT1、phrpD51和phpa3。通过软件分析后还发现,hrpB转录单元中的hrcN和hrpD转录单元的hpaP基因内存在可能的启动子,分别为phrcT2和phrpD52。将上述启动子分别与gusA基因进行融合,导入野生菌中,在水稻细胞、hrp诱导培养基XOM3和NB中进行GUS活性测定。结果发现,phrcC、hrcT1、prhD51和phpa3启动子可以驱动gusA基因在水稻细胞和XOM3中诱导表达,而不能有效在NB中表达。相应的,phrcT2和phrpD52在三种条件下都能驱动gusA基因表达。 为了排除全局性调控因子对上述基因表达差异的调控作用,本研究将上述hrp-gusA构建以及hrpG和hrpX基因的启动子分别导入hrpG、hrpX、trh、lrpX、colR、colS和zur突变体中,结果发现,hrpA转录单元受HrpG、Zur、ColR和Trh的正调控,不受HrpX、LrpX和ColS的调控;hrpB转录单元受HrpX正调控,不受其他因子的调控;hrpD转录单元同时受HrpG和HrpX调控,不受其他五个全局性调控因子的调控;hrpG基因受Trh正调控,不受其他调控因子的影响;hrpX基因受HrpG的正调控影响最大,其次受Zur和Co1R的正调控,但还受LrpX的负调控作用。这表明,这些调控因子通过对hrpG或hrpX基因的转录调控作用而间接的影响hrp基因的转录表达。而五个全局性调控因子以及HrpG和HrpX对phrpD52和phpa3没有调控作用。这也提示,hrpD5、hrpE和hpa3的调控受到未知调控因子的作用。 为了揭示这些因子在转录后水平上对hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3的调控作用,本研究利用Northern杂交对上述调控因子突变体中的hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3基因表达进行了分析。结果发现,hrpE基因在hrpX突变体中仍然有低水平的转录,而在lrpX突变体中表达水平超过野生型。这提示,hrpE基因的表达并不受HrpG、Trh、ColR、ColS和Zur的调控,但受到HrpX的显著正调控作用,并且LrpX对HrpX的负调控,导致hrpE转录水平升高。遗憾的是,hrcC、hrpD5和hpa3的mRNA水平太低,没有杂交信号出现。 由于hrpD5、hrpE和hpa3不完全依赖hrpG和HrpX调控,这促使本研究进一步对其所在的转录单元构成进行分析。对phrpD51和phrpD52进行突变,经诱导通过RT-PCR分析后发现,hrpD转录单元的启动子phrpD51突变后,除hrpD5和hrpE基因外,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaP、hrpD6、hrpE和hpaB基因不转录表达,而可能的启动子对上述基因(hpaP除外)的转录没有影响。这说明hrcQ到hpaB基因同处一个转录单元中,而hrpD5基因的转录可能受到另外调控因子的作用。为了证实这个结果,本为从hrpC转录单元的hpaP基因开始,以hrpE3基因为终点,以两两基因为对象,通过RT-PCR扩增发现,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6、hrpE和hpaB基因处于同一转录单元中。这一结果不同于其它植物病原细菌黄单胞菌的转录单元构成,但与水稻白叶枯病菌的相应的转录单元相同。 为了进一步说明HrpD6对hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的调控作用以及对hrpG和hrpX的转录表达有影响作用,本研究将细hpa2和hpa1的启动子phpa2和phpa1以及phrcC、phrcT和phrpD51与gusA的融合构建,分别置于hrpD6突变体和野生型中,经XOM3诱导表达后GUS活性检测发现,HrpD6对hpa2、hpal和hrcC基因以及hrpB转录单元有正调控作用,对hrpG、hrpX基因和hrpD转录单元转录表达没有影响。 为了蛋白质水平上检测hrpD6突变后,影响了Hpa2和Hpa1的产生,本研究将hpa1和hpa2基因与c-Myc标签进行融合,分别置于野生菌株、T3S突变体hrcV突变体和hpaB突变体中。蛋白免疫杂交结果显示,hrpD6突变体和hpaB突变体中无Hpa2和Hpa1蛋白的分泌。这说明,hpa2、hpal和hpaB基因在转录水平上就受到了HrpD6的调控。为了进一步分析HrpD6对hpaB基因的调控作用,本研究以HpaB依赖而分泌的效应分子AvrXa27和不依赖HpaB而分泌的转位元HrpF为报道基因,分别与FLAG和c-Myc进行融合,导入野生菌、T3S突变体hrcV、hrpD6和hpaB突变体中,经过相同的诱导,蛋白质免疫杂交结果显示,hrpD6突变后,与同hpaB突变体一样,AvrXa27不分泌,HrpF仍能进行分泌。这表明,hrpD6基因突变后,hpaB基因不转录表达,从而AvrXa27不能进行分泌,而不依赖HpaB的HrpF能够进行分泌。明确HrpD6是hrp-hrc-hpa基因的调控因子,在黄单胞菌的hrp基因调控中还属首次报道。 X. oryzae pv. oryzicola的hpa2基因位于hrp基因簇最左端,启动子区域存在imperfect PIP-box,其基因产物属lytic transglycosylase家族,推测其可能溶解植物细胞壁从而使T3SS发挥作用。hrpF基因位于hrp基因簇的右端,在寄主细胞膜上形成转位装置将效应蛋白转运至寄主细胞中。Hpa2和HrpF是否互作,从而决定病原菌的致病性,还不清楚。本研究发现,hpa2和hrpF基因分别突变后,降低了在水稻上的毒性,细菌生长能力减弱,但不影响在非寄主烟草上的HR。hpa2和hrpF同时突变后,X. oryzae pv. oryzicola在水稻上丧失了water soaking症状和致病性,但在非寄主上仍有HR激发能力。转录水平研究发现,hpa2基因的表达受HrpG调控,不受HrpX调控。细胞定位结果显示,Hpa2作用于植物细胞膜上而非细胞壁。蛋白质互作和免疫杂交结果显示,Hpa2通过T3SS进行分泌,并与HrpF互作,控制T3S效应分子AvrXa27转位进入水稻细胞中,但在hrp诱导培养基上仍等检测到AvrXa27的分泌,推测Hpa2和HrpF互作形成复合体,控制效应分子转位进入植物细胞内,从而影响病原菌的致病性。 水稻条斑病菌的HrpX能够调节hrp基因的表达,而在被调节的因子启动子区域一般含有PIP-box (plant-inducible promoter, TTCGC-N15-TTCGC).为了研究HrpX对hpa1的调控机制,通过in vivo策略,将启动子区域含有PIP-box的hpa1基因启动子分别与绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein, gfp)进行融合(phpa1::gfp),两亲交配导入水稻条斑病菌野生型菌株和hrpX突变体中,借助水稻悬浮细胞诱导表达系统,观察启动子启动gfp的表达情况。结果发现,在hrpX基因突变体ARhrpX中,融合基因不转录表达,ΔRhrpX中菌体不显示荧光。同时RT-PCR结果揭示,ARhrpX中hpa1基因不能转录表达。以上结果表明,水稻条斑病菌中hpa1的转录表达受到HrpX的调控。 水稻条斑病菌的hpa1是唯一已知的编码Harpin的基因,但是其在引起细胞死亡的生理生化机制尚不清楚。为此,基于对Hpal的氨基酸序列分析,本研究将Hpal缺失互补丧失HR的双突变体ARhpa1△hrpF观察HR,结果显示Hpa1 N端的α-helix决定其在非寄主烟草上产生HR,且第47位(C)和第53位(L)氨基酸是关键氨基酸。通过瞬时表达GFP,洋葱表皮定位显示Hpal主要定位于细胞膜上,暗示其可能通过破坏植物细胞膜起作用。根据X. oryzae pv. oryzae中的AvrXa10和Xa10的特异性互作关系,同时以avrXa10为报道基因,将RS105hpa1 N端60aa与缺失N端分泌信号(A28aa)的avrXalO融合后导入X. oryzae pv. oryzae PXO99A中,接种含有Xa10的水稻品种IRBB10观察褐色抗病反应,结果表明Hpa1能经细菌T3S进行分泌,Western Blot(?)必出性检测结果与此一致。这将为进一步揭示非寄主抗性提供更多的理论依据和有利线索。 鉴于调控元件PIP-box序列保守性,可以将其作为一个有效的筛选标记从大量的基因组数据中获得HrpX调节子。基因组信息提示,X. oryzae pv. oryzicola的很多基因在启动子区域都含有完整或不完整的PIP-box。因此为了从X. oryzae pv. oryzicola中获得更多受HrpX调节的基因,本研究选取5个候选因子(hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234)借助启动子-gfp(PIP-gfp)融合表达方法,导入X. oryzae pv. oryzicola hrpX基因突变体中,与水稻悬浮细胞互作后观察荧光有无或强弱,建立了筛选HrpX调节子的体系,同时也提示某些含有imperfect PIP-box的因子如kgtP和Z1234也是HrpX调节子,这为新的Ⅲ型效应分子的发掘提供依据。 鉴于X. oryzae pv. oryzicola hpal基因编码产物Harpin具有在非寄主烟草上激发过敏反应的能力,其产物体外施用诱导植物产生多种有益表型,如抗病、抗虫及促生等,而转基因手段则可以实现其在植物体内的运用。为此,将水稻条斑病菌的hpa1放在组成型表达的CaMV35S启动子下获得重组质粒pBIhpa1。但Hpa1并没有直接的杀菌活性,为此将Hpa1和Cecropin A (CA)(?)勺α螺旋结构以及Meltin (ME)的α螺旋结构通过polylinker以及自由环进行连接,获得具有杀菌功能的融合基因hcm1。通过3种不同的构建策略将hcm1基因分别放在组成型表达的CaMV35S启动子、受病原菌诱导表达的hsr203J和PR1α启动子下获得重组质粒pBIhcml、pBIhshcml和pBIPRhcml。将上述转基因重组质粒转化根癌土壤杆菌EHA105菌株,通过农杆菌介导的方法,进行水稻武粳15的成熟胚愈伤组织的转化,获得hpa1和hcm1转基因水稻植株,能够激活水稻防卫反应,并能表现出对稻瘟病、水稻纹枯病的抗性。另外进行小麦扬麦158的幼胚愈伤组织的转化,对已有的转化体系进行优化,经抗性筛选和初步PCR检测获得hcm1转基因小麦植株。


知网文化
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978