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昆虫病原线虫共生菌菌株09FLYB1的分离鉴定及其杀虫毒素蛋白的分离纯化与活性研究

房云  
【摘要】:昆虫病原线虫共生细菌寄生于昆虫病原线虫肠道内,二者互惠共生。昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含3个属:致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)和沙雷氏菌属(Serratia),分别与斯氏科(Steinernematidae)、异小杆科(Heterorhabditidae)和小杆科拟异小杆属(Heterorhabditidoides chongmingensis)线虫共生。 利用大蜡螟幼虫诱捕线虫的方法从宜兴土样中的分离出一种昆虫病原线虫,标记为09FLY1。从该线虫体内分离到一株杀虫活性较强的共生菌菌株09FLYB1。该菌株为革兰氏阴性菌,有鞭毛,无芽孢,菌体呈短杆状。 通过构建菌株09FLYB1 16S rDNA系统发育树,结合生理生化性状从而确定其为沙雷氏菌属细菌。16S rDNA同源性比对分析表明菌株09FLYB1与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T和Serratia marcescens subsp. Sakuensis KREDT的同源性最高,都是99.855%;菌株09FLYB1的生理生化性状与Serratia nematodiphilaDZ0503SBS1T最为接近,只有3个性状不同;数值分类结果显示菌株09FLYB1也与Serratia nematodiphila DZ0503SBS1T的相似性系数最大(0.86);这些结果表明菌株09FLYB1是Serratia nematodiphila的一个菌株。 共生菌菌株09FLYB1的生长曲线测定表明符合一般细菌的生长规律,共生菌在对数生长初期即产生胞外杀虫蛋白,在对数生长末期(28 h)血腔毒力达到最大,此时昆虫死亡率为100%,确定共生菌菌株胞外杀虫蛋白最优发酵时间为28 h。 测定09FLYB1发酵液上清对大蜡螟初孵幼虫和老熟幼虫的毒力。当1 g人工饲料中添加100肛g发酵液脱盐冻干粉时,168 h后初孵幼虫的校正死亡率为32.6%,存活幼虫的体重抑制率为48.2%。发酵液上清液中的杀虫物质对蛋白酶K敏感,上清液经蛋白酶K水解处理后杀虫活力下降很大,死亡率仅为8.3%;表明发酵液中杀虫活性主要组分为蛋白质。用不同浓度的病原菌发酵液对大蜡螟老熟幼虫的血腔毒力测试结果表明,菌株发酵液中粗蛋白对大蜡螟老熟幼虫的半数致死浓度为1.7μg·μL-1。 09FLYB1胞外杀虫蛋白粗提物冻干粉经Sephadex G-75凝胶层析出现2个峰,分别标记为09FLYB1G-Ⅰ和09FLYB1G-Ⅱ.1g人工饲料中分别添加100μg 09FLYB1G-Ⅰ和09FLYB1G-Ⅱ冻干粉检测胃毒活力,168 h后09FLYB1G-Ⅰ对昆虫的校正死亡率为52.8%,存活幼虫的体重抑制率为75.3%;09FLYB1G-Ⅱ对昆虫的校正死亡率为11.5%,存活幼虫的体重抑制率为25.6%。该结果显示09FLYB1G-Ⅰ为胃毒力活性峰。检测血腔毒力时,向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为2μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液,09FLYB1G-Ⅰ的校正死亡率为94.7%,09FLYB1G-Ⅱ的校正死亡率为25%,表明09FLYB1G-Ⅰ为血腔毒力活性峰。 将09FLYB1G-Ⅰ过DEAE Sepharose FF阴离子交换柱,得到1个峰,标记为09FLYB1D-Ⅰ。检测胃毒活力时,按照1 g人工饲料中添加100μg冻干粉的比例添加09FLYB1D-Ⅰ,09FLYB1D-Ⅰ校正死亡率为53.6%体重抑制率为78.2%。检测血腔毒力时,向每头大蜡螟体内注射10μL浓度为2μg·μL-1杀虫蛋白冻干粉溶解液,09FLYB1D-Ⅰ校正死亡率为100%。 非还原性SDS-PAGE图谱和还原性SDS-PAGE显示,杀虫蛋白经过分子筛和离子柱分离纯化后,在分子量50 kDa附近有一明显蛋白条带,表明该蛋白只有一个亚基。根据非还原性SDS-PAGE图谱计算该杀虫蛋白的相对分子质量约为53.24 kDa,标记为09FLYB1P53。进一步测定杀虫蛋白09FLYB1P53对大蜡螟幼虫致死中浓度(LC50),杀虫蛋白09FLYB1P53的血腔毒力半数致死浓度为0.4μg·μL-1;胃毒毒力半数致死浓度为96.94μg·g-1.


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