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红肉苹果MYB类转录因子的克隆及功能分析

展蔷  
【摘要】:长期以来,运用传统的育种手段对多年生木本果树进行遗传改良时,由于受到童期较长等因素的影响,育种进程较为缓慢。基因工程技术的迅猛发展使其成为育种的一种重要的有巨大发展潜力的手段。MYB类转录因子广泛存在于植物中,几乎参与了植物发育和代谢的各个方面。近年来,发现了一系列MYB转录因子参与调控植物类黄酮合成途径的调控,进而影响到植物花器官和果实的着色,因此,克隆MYB基因并研究验证其功能有着深远意义。 本文结合红肉苹果的特点,利用了PCR、RACE、电子克隆等技术先后克隆了MpMYBPA1、MpMYB5B、MpMYB30等三个MYB类转录因子,对三个基因在红肉苹果及模式植物中的功能特性进行了初步研究,以期为利用这些基因进行苹果或其它果树的基因工程改良及表达调控提供理论依据。主要研究结果如下: 1.利用PCR等技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana schneid.)中获得了MpMYBPA1的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测,并将其分别连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体和pYK2784-EGFP亚细胞定位载体中。结果表明:该基因全长为1020bp,编码340个氨基酸;其碱基序列经系统发育分析与葡萄MYBPA1同源性最高,命名为MpMYBPA1,其N端MYB特征结构域。半定量RT-PCR分析结果表明,MpMYBPA1在果实中表达量最大,并受到温度和ABA不同程度上的影响。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,MpMYBPAl基因表达产物定位在细胞核中,符合转录因子特性。构建了MpMYBPA1植物双元表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草PCR检测发现其中4个hyg阳性株系检测到目的条带,初步说明MpMYBPA1已整合到烟草基因组中。对hyg阳性株系再次进行RT-PCR检测,结果表明MpMYBPA1在有些转基因烟草中均发生了转录。 2.利用PCR,电子克隆技术从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana schneid。)中获得了MpMYB5B的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其分别连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体和pYK2784-EGFP亚细胞定位载体中。结果表明:该基因全长为1577bp,编码374个氨基酸;其碱基序列经系统发育分析与葡萄VvMYB5B的同源性高达90%,命名为MpMYB5B,其N端含有两个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。半定量RT-PCR分析结果表明,MpMYB5B基因果实中表达量最大,并受到不同温度,ABA的影响。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,MpMYB5B基因表达产物定位在细胞壁中。构建了MpMYB5B植物双元表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草,共获得9株hyg阳性苗。PCR检测发现其中6个hyg阳性株系检测到目的条带,初步说明MpMYB5B已整合到烟草基因组中。对其中PCR阳性株进行RT-PCR检测,结果表明MpMYB5B在这些转基因烟草中均发生了转录。 3.利用RACE、PCR技术从野生红肉苹果(Malus pumila var。niedzwetzkyana schneid.)中获得了MpMYB30的全长序列,利用生物信息学的方法对其蛋白进行了分析和预测并将其连接到pCAMBIA-S1300+植物表达载体中。结果表明:该基因全长为1661bp,推导的氨基酸序列经系统发育分析与葡萄MYB30及蓖麻MYB基因相似性最高,命名为MpMYB30,其N端含有两个约55个氨基酸组成的MYB特征结构域。该基因推导的MpMYB30蛋白的分子式为C1790H2794N5380584S12,相对分子质量为41579.8,等电点为6.30,不存在信号肽和跨膜区域,蛋白质结构以α螺旋为主。利用XbalⅠ和Sac I对重组质粒进行酶切,并将其连接到pCAMBIA-S1300+载体上,通过抗性筛选和PCR酶切检测,证实了MpMYB30基因已经构建到植物表达载体pCAMBIA-S1300+上。


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