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簇毛麦抗白粉病基因Hv-S/TPK的抗病机理分析及其旁侧抗病基因类似物的克隆

胡佳梦  
【摘要】:小麦白粉病是由白粉病菌(Ergsiphe graminis f.sp.tritici)引起的世界性专性寄生真菌病害,在中国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重。培育抗性品种是控制白粉病的有效途径。来自于小麦近缘物种簇毛麦的抗白粉病基因Pm21对白粉病抗性强、抗谱广,已经作为我国小麦抗白粉病育种的新一代抗源被广泛利用。鉴定Pm21基因发挥抗病作用过程中所涉及的转录因子、信号传导途径和重要防卫反应基因,克隆抗白粉病相关基因,对于研究广谱抗性机理以及利用基因工程手段提高小麦对白粉病的抗性具有重要意义。 本实验室已经通过基因芯片技术筛选到一个白粉菌诱导后上调表达的抗病相关基因Hv-S/TPK,并获得了它的全长cDNA序列。把该基因转入感白粉病的小麦品种扬麦158后可提高扬麦158的白粉病抗性,该基因可能是Pm21位点的重要成员。虽然在扬麦158中存在Hv-S/TPK的直系同源基因,但该品种没有表现出对白粉病的抗性的原因尚不清楚。本研究根据Hv-S/TPK的序列设计引物,从小麦B、D基因组中克隆出它的两个直系同源基因,分别命名为Ta-B-S/TPk和Ta-D-S/TPK。在DNA水平上,Hv-S/TPK.Ta-B-S/TPK和Ta-D-S/TPk都是由6个外显子组成,开放阅读框(ORF)长度为1206个碱基,编码401个氨基酸。Ta-B-S/TPk的第5个内含子比Ta-D-S/TPk和Hv-S/TPK要长。氨基酸序列比对结果表明Ta-B-S/TPK和Ta-D-S/TPK突变的位点集中在N端和C端,而不在激酶功能区中。氨基酸突变导致蛋白质的三维结构发生变化,小麦中的S/TPk的N端和C端的肽链呈展开状,而Hv-S/TPK的N端和C端则呈向内折叠状。 为了进一步研究Hv-S/TPK基因的抗病机理,取扬麦158、小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137和过量表达Hv-S/TPK基因的转基因植株的叶片离体接种白粉菌,观察白粉菌的发育情况。结果表明,扬麦158中白粉菌可以正常发育长出吸器并在120h后生成大量菌丝和孢子链:92R137中部分孢子可以发育长出吸器并可产生少量的一级菌丝,但没有二级菌丝产生,部分受孢子侵染的细胞很快产生过敏性坏死:转基因植株中白粉菌孢子不产生吸器,只在与孢子互作的细胞中发生过敏性坏死。半定量RT-PCR表明在簇毛麦和92R137中,Hv-S/TPK基因受白粉菌诱导表达;在扬麦158中,S/TPk基因不受白粉菌诱导表达,始终处于本底水平;在转基因株系中,Hv-S/TPK基因始终处于一个较高的表达水平。Hv-S/TPK的抗性与其表达量有密切关系。 为了研究Hv-S/TPk和它在小麦中的直系同源基因在抗白粉病功能上的差别,分别构建了Ta-D-S/TPK与Hv-S/TPK的瞬间表达载体,用基因枪法分别将这两个表达载体和GUS表达载体共同轰击感白粉病小麦品种扬麦158号,高密度接种白粉病菌,观察GUS表达细胞的白粉菌吸器指数。共转化(Ta-D-S/TPK+GUS)的叶片表皮细胞有效地提高了白粉病抗性,吸器侵入率为15.34%,略高于转化(Hv-S/TPK+GUS)的叶片(13.65%)和只转化GUS基因的92R137叶片(14.08%)。该结果说明,Ta-D-S/TPK和HV-S/TPK都具有小麦白粉病抗性。 由于抗白粉病基因Hv-S/TPK基因位于簇毛麦短臂上一个比较小的区段,为了在该区段筛选更多的抗病候选基因,本研究以HV-S/TPK为出发点,筛选其旁侧抗病基因类似物。小麦第六部分同源群染色体与水稻第2条染色体之间存在共线性,通过搜索Genbank,获得了水稻第2条染色体上位于Hv-S/TPK基因上下游的BAC序列,进一步根据其中抗病基因类似物的序列设计引物在簇毛麦中筛选抗病基因类似物。最终筛选到6个定位于6V染色体短臂上的抗病基因类似物。 利用其中一对(14940F/14940R)引物筛选簇毛麦叶片cDNA文库,克隆到一个编码丝氨酸苏氨酸激酶的基因。该基因cDNA全长2491个碱基,其中5’-UTR区有404个碱基,3’-UTR有692个碱基,ORF编码464个氨基酸。推导的蛋白质序列中含有一个丝氨酸苏氨酸激酶活性区和一个NAF结构域,属于SnRK3亚族,命名为Hv-CIPK(Haynaldia villosa CBL-interacting protein kinase)。半定量RT-PCR表明Hv-CIPK在白粉菌诱导后的小麦和簇毛麦叶片中表达量没有明显变化。构建了Hv-CIPK的表达载体,应用基因枪法转化小麦,得到转基因植株125株,经鉴定阳性植株67株。接种白粉病后田间调查发现部分转基因小麦与对照相比发病推迟或病情较轻。


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