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过表达线粒体热激蛋白70抑制水稻悬浮细胞程序性死亡

齐耀程  
【摘要】:细胞程序性死亡(PCD)在植物的发育、抗病及植物与环境互作等过程中发挥着极其重要的作用。而线粒体作为细胞重要的细胞器,在植物PCD过程中具有关键性调节功能。本实验室前期研究发现,水稻幼苗在500mM NaCl胁迫下,其根尖细胞出现典型细胞程序性死亡特征。根尖细胞的线粒体蛋白质组分析也表明线粒体热激蛋白70(mtHSP70)在PCD早期的表达量显著上升。 为了研究mtHSP70在PCD中发挥的生物学功能,本研究以日本晴水稻悬浮细胞系为受体材料,在水稻悬浮细胞中导入未经改造的pCAMBIA1304载体的作为空载体对照(VC),过表达mtHSP70(?)悬浮细胞(OX)为材料制备原生质体,48℃水浴热激处理15min后发现,在28℃恢复培养条件下水稻原生质体随时间延长出现明显的PCD特征,包括DNA片段化、细胞核呈TUNEL阳性、染色质凝集、线粒体膜电势显著降低等。VC原生质体在热处理后,恢复培养2h其基因组DNA可降解出现明显的DNA Ladder,而OX原生质体DNA Ladder出现于恢复培养4h左右。100mM H2O2引发原生质体DNA Ladder (?)勺结果与热诱导相似。热诱导下VC原生质体死亡率6h可达到63.2%,OX仅为39.3%。H2O2处理时VC原生质体死亡率6h即可达到91%,OX也仅为43%。将热处理的原生质体利用Hoechst33342荧光染色观察到热激后细胞核破裂和染色质凝聚等PCD形态学变化,VC细胞核裂解程度较大,OX原生质体恢复培养6h的核裂解程度相当于VC恢复培养12h的状态;经TUNEL染色可以发现,虽然两类原生质体进入PCD的细胞数目随时间延长而都呈增长趋势,但是OX恢复培养24h的阳性率为70%,而VC原生质体的阳性率却已超过90%,这说明过表达mtHSP70可以降低Ca2+或Mg2+依赖性核酸内切酶的活性,延缓了PCD的发生进程;热激处理均可诱导两种类型原生质体的细胞色素c从线粒体释放到细胞质中,Western Blot检测显示细胞色素c释放量15min内随热处理时间延长而增大。 热激诱导PCD初期,VC原生质体内活性氧爆发并于1.5h和2.5h出现两个爆发峰,而OX原生质体内活性氧的水平稳步上升,避免了短时间内突发的极端氧化伤害;线粒体膜电势测定发现热激诱导的原生质体PCD过程中,线粒体膜电势均有下降,但VC原生质体中线粒体膜电势下降速度较快,表明过表达mtHSP70细胞的线粒体膜完整性高,线粒体损伤程度小;VC原生质体的类Caspase-3活性随恢复培养时间延长而增强,其6h的相对荧光值是OX的8倍,而OX的荧光强度一直保持平稳的本底水平,可能是原生质体通过过表达mtHSP70稳定线粒体膜电势防止促PCD因子的释放而抑制了胞质内类Caspase-3的活化。 本研究证明了线粒体热激蛋白70通过稳定线粒体膜电势和抑制活性氧爆发,有效延缓了热激诱导下水稻悬浮细胞原生质体PCD的发生。


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