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蝴蝶兰、文心兰离体培养及其化学诱变研究

崔广荣  
【摘要】:本文以建立蝴蝶兰、文心兰离体化学诱变技术体系为目的,着重探索了适合于蝴蝶兰、文心兰化学诱变的离体培养条件,建立和优化了蝴蝶兰、文心兰类原球茎液体增殖培养、类原球茎薄切片培养及蝴蝶兰叶片胚状体高效发生技术体系,并以离体培养技术体系为基础,分别建立了2种兰花秋水仙素、叠氮化钠、甲基磺酸乙酯离体化学诱变技术体系,获得了大量的蝴蝶兰、文心兰多倍体植株及EMS诱变产生的少量形态变易植株,并对多倍体植株进行了形态学、细胞学鉴定,对叠氮化钠、甲基磺酸乙酯诱变再生植株进行了RAPD鉴定。 1.蝴蝶兰、文心兰离体培养 细胞分裂素6-BA对胚状体的诱导效果较Ad好,NAA与二者配合使用可提高胚状体的发生率,其最佳浓度组合为6-BA4.0mg/L+Ad2.0~4.0mg/L+NAA1.0~2.0mg/L。蔗糖20~40g/L+椰汁100~200ml/L有利于提高胚状体的发生频率。胚状体起源于叶片气孔附近的上表皮细胞或上表皮下方的叶肉组织细胞,为单细胞起源,其发育过程与一般植物胚状体发生发育特征相似,最终发育成为类原球茎。 不同浓度的外源激素及其配比对蝴蝶兰类原球茎增殖和生长影响较大6-BA2.0mg/L+Ad1.0mg/L+NAA0.5mg/L的激素浓度组合比较适合蝴蝶兰类原球茎增殖,蔗糖浓度对蝴蝶兰类原球茎增殖和生长影响较大,适合蝴蝶兰PLBs增殖的蔗糖浓度为20g/L,添加10-40%的新鲜椰汁对蝴蝶兰类原球茎增殖生长有明显促进作用;类原球茎液体增殖培养的时间不宜超过4周,5周内连续培养增殖曲线呈倒“V”字形;液体增殖培养的类原球茎分化成苗的时间相对较晚。 特定浓度的3种植物生长调节剂的组合使用是PLBs高频发生的关键;培养基中添加椰汁能有效提高PLBs的诱导频率,培养基中高浓度蔗糖降低文心兰PLBs发生频率,但对蝴蝶兰影响不大;各处理诱导的PLBs在生长状况上差异不明显。适合两种兰花类原球茎薄切片高频诱导PLBs的固体培养基是1/2MS+4.0mg/L6-BA+2.0mg/L Ad+1.0mg/L NAA+100~200ml/L椰汁+10-20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂粉。 不同浓度的外源激素及其配比对文心兰PLBs增殖生长影响较大6-BA0.5mg/L+Ad0.05mg/L+NAA0.05mg/L的激素组合比较适合文心兰PLBs增殖;蔗糖浓度对文心兰PLBs增殖的影响也较大,适合文心兰PLB在液体培养条件下增殖的蔗糖浓度为7.5g/l;添加5%新鲜椰汁不仅对文心兰PLBs增殖有促进作用,而且能改善PLBs的质量;适合文心兰PLBs增殖的培养基为MS+6-BA0.5mg/L+Ad0.05mg/L+NAA0.05mg/L+5%椰汁+7.5g/L蔗糖。文心兰PLBs在5周内的增殖生长曲线呈倒“V”字形,第3周的增殖速度达最高峰,而固体培养基PLBs增殖速度较慢,生长曲线几乎成直线。液体增殖的PLBs分化成苗较固体培养增殖的PLBs差。 2.蝴蝶兰离体化学诱变及其鉴定 不同浓度秋水仙素对蝴蝶兰类原球茎的生长状况均产生一定影响,类原球茎相对膨大,表面粗糙,呈暗绿色,浓度越大、处理时间越长,影响越明显;不同浓度秋水仙素诱变时间长短与类原球茎内部细胞结构发生变化的程度关系密切;秋水仙素处理后的类原球茎分化苗周期增长,成苗率降低;不同处理多倍体诱导频率不同,最高诱变率可达40.0%;多倍体在形态、细胞组织学上与二倍体差异明显,细胞核变大,染色体数目加倍。 诱变剂NaN3、EMS对类原球茎薄切片生长均产生重要影响,部分薄切片及其再生类原球茎白化或褐化死亡,再生类原球茎生长受到抑制,再生苗数量减少,表现出明显的伤害作用,这种伤害作用随诱变剂浓度的加大和处理时间的延长而加重;诱变剂NaN3和EMS均能使部分再生苗畸变,叶片皱缩、变厚。10条RAPD引物PCR检测表明,再生苗DNA序列发生了一定的变异,表现出RAPD图谱带型的多态性。NaN3适合诱变剂量为浓度3-6mmol/L处理2d,EMS合适的诱变剂量为浓度0.4%处理2-4d。 3.文心兰离体化学诱变及其鉴定 秋水仙素对文心兰离体薄切片类原球茎的形成及其再生苗产生较大影响,较高浓度的秋水仙素处理较长时间时,形成类原球茎的薄切片比率及再生苗数减少明显,但多倍体形成的比率相对较高;多倍体苗叶片厚实、紧凑、植株较矮;叶片下表皮组织细胞、气孔结构与二倍体存在一定差异,细胞核明显较大,染色体加倍成功。 诱变剂NaN3、EMS对类原球茎薄切片生长均产生重要影响,部分薄切片褐化死亡,再生类原球茎生长受到抑制,再生苗数量减少,表现出明显的伤害作用,这种伤害作用随诱变剂浓度的加大和处理时间的延长而加重;NaN3抑制再生苗生长,试管苗普遍矮小,但EMS对试管苗的生长影响不大。10条RAPD引物PCR检测表明,再生苗DNA序列发生了一定的变异,表现出RAPD图谱带型的多态性,随着诱变剂浓度的加大和处理时间延长,多态性比例升高,但EMS在浓度达0.4%时,多态率升高不明显。NaN3适合诱变剂量为浓度6mmol/L处理2~4d,EMS合适的诱变剂量为浓度0.4%处理2~4d。


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