收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

枯草芽孢杆菌脂肽化合物合成调控基因功能研究及多功能生防工程菌株的构建

伍辉军  
【摘要】:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有生长速度快,代谢产物丰富,利用开发价值高以及食用安全等显著优点,广泛应用于农业生物防治。研究枯草芽孢杆菌快速分子鉴定方法以获得更多具有应用价值的新菌株具有重要意义。 采用16S rDNA序列分析法对本实验室采用传统方法鉴定的枯草芽孢杆菌菌株B3、38、43、49、55、85进行鉴定结果表明:测定的芽孢杆菌菌株与已报道的枯草芽孢杆菌属具有高度的同源性,其中B3、38、43、49、55、85菌株的16S rDNA与模式菌株168的同源性分别为99.4%、99.5%、99.7%、93.8%、96.8%和99.4%。B3的16S rDNA序列已经登录到了GenBank上,登录号为:EF492885。应用DNAstar软件对这些序列进行分析,构建了系统发育树,B3、38、43、49、55、85与枯草芽孢杆菌模式菌株168聚在一起,说明它们的亲缘关系较近。 基质协助激光解吸附/电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术是近年来发展起来的新的质谱离子化技术,通过对细菌成分的分析,来鉴定细菌的类别。为快速准确鉴定枯草芽孢杆菌,本研究采用MALDI-TOF-MS对本实验室分离保存的枯草芽孢杆菌菌株B3、38、43、49、55、85进行分析,以来自美国菌种保藏中心菌株168,ATCC6633、 ATCC13952、ATCC21332,及柏林理工大学Dr.Joahim Vater惠赠的菌株A1/3、b213、C1为标准菌株。分析结果表明,枯草芽孢杆菌菌株一般出现3-4条谱带,其中m/z为379、493、618、714、843和969是经常和比较稳定出现的特征性信号谱带。 我们对上述鉴定的枯草芽孢杆菌进行了油菜菌核病菌和水稻白叶枯病菌的平板抑菌实验。结果表明,菌株B3、38、43、49、55和85对油菜菌核病菌具有显著的抑制菌丝生长的作用,MALDI-TOF检测表明,这些菌株能够产生抑制真菌的脂肽化合物fengycin和iturin family(Bacillomycins D、Iturin和Mycosubtilins).而38、43、55和85还对水稻白叶枯病菌具有显著抑制作用,可以用这些菌株能够产生具有抑制细菌活性的脂肽化合物surfactin来解释。 为了提高枯草芽孢杆菌脂肽活性物质的产量,对脂肽化合物合成调控区的两个未知功能的基因ycxD和aspB3进行了初步的研究。枯草芽孢杆菌存在十多种GntR家族转录调控子,参与细菌中各种不同的生物过程的调控。基因功能预测表明,ycxD基因编码产物属于GntR家族转录调控子,并具有转氨酶的结构域。AspAT转氨酶编码基因也有十多个,这类酶对枯草芽孢杆菌氮和碳代谢起到非常重要的作用。基因功能预测表明,aspB3基因编码产物具有天冬氨酸转氨酶的功能域。为了验证这两个基因编码产物是否具有转氨酶的活性,本研究分别构建了大肠杆菌表达载体pETycxD和pETasp,并利用Ni柱纯化重组蛋白。转氨酶活性研究表明,YcxD蛋白不具有转氨酶的功能,推YcxD蛋白可能属于GntR转录调控因子家族,具体的功能有待进一步深入研究。酶活性检测表明,AspB3蛋白属于天冬氨酸转氨酶家族。对AspB3蛋白的酶学性质深入研究表明,AspB3转氨酶的最适反应温度为40℃,最适PH值为8.2,最适底物为L-Asp。该酶的热稳定性强,并且金属离子对酶反应有影响。AspB3蛋白的序列分析和系统发育研究表明AspB3转氨酶是新型的热稳定性天冬氨酸转氨酶,属于AspAT家族的I。亚家族。催化活性位点的研究表明:AspB3蛋白中D232残基的功能是固定辅酶,加强辅酶的吸电子能力和加速反应的活性;K270残基是辅酶PLP的结合部位;R403残基直接参与二羧基底物识别。目前,E.coli AspAT被应用于酶法生产氨基酸。例如,生成的L-苯丙氨酸(L-Phe),但E.coli AspAT的热稳定性不强制约着这种酶法生产氨基酸的大规模应用。相比之下AspB3转氨酶具有热稳定性强、酶活性高,最适温度偏碱的优势,因此AspB3转氨酶具有应用生产L-Phe的价值。 为了向枯草芽孢杆菌中引入新的生防作用因子,本研究利用芽孢杆菌分泌表达系统,构建了能分泌HpaGxooc蛋白的枯草芽孢杆菌基因工程菌。HpaGxooc是由水稻细条斑菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)产生的一种非特异性蛋白激发子,属于harpin蛋白家族。HpaGxooc能激发非寄主植物的过敏性坏死,诱导植物抗虫、抗病和抗旱,而且能促进植物生长。在本研究中,为了利用芽孢杆菌表达系统分泌表达HpaGxooc构建了pMSF.pM43SF和pM43HF三个表达载体。pMSF重组载体含有Hpall组成性启动子和nprB信号肽组件;pM43SF和pM43HF两个重组载体都含有P43强启动子和nprB信号肽组件,不同的是为了快速地纯化分泌的重组蛋白,pM43HF分泌的HpaGxooc的C端融合了6×His tag标签。SDS-PAGE和Western blot实验结果表明芽孢杆菌能够分泌表达HpaGxooc蛋白。ELISA分析结果表明,B. subtilis WBSF1(pMSF)的HpaGxooc表达量低于B. subtilis WBSF2(pM43SF)和B. subtilis WBHF(pM43HF),该实验证明了在芽孢杆菌中HpaⅡ启动子活性低于P43启动子。我们又将高效表达载体pM43HF转入surfactin生产菌株B. subtilis OKB105中,得到了基因工程菌株B. subtilis OKBHF。Western blot和ELISA检测表明B. subtilis OKBHF的HpaGxooc表达量低于WBHF。ELISA测定了B. subtilis WBHF分泌HpaGxooc的最佳培养条件。B. subtilis WBHF分泌的HpaGxooc的生物学功能的测定表明:该重组蛋白能激发烟草的HR(hypersensitive response)反应,和促进烟草根系的生长。RT-PCR分析表明HpaGxooc能诱导烟草防卫反应中病程相关基因PR-la and PR-1b的表达。


知网文化
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978