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青虾ITS1序列SNP位点的筛选及其在杂交遗传分析中的应用

张洪伟  
【摘要】:青虾,学名日本沼虾,是我国重要的淡水养殖虾类。SNP分子标记是继RFLP和微卫星标记之后最有发展前途的第三代分子标记技术,已在鱼、虾、蟹、贝等水产动物中得到了研究和应用,但迄今未见有关青虾SNP标记筛选及其应用的报道。 本文在筛选合适扩增引物的基础上,采用PCR产物直接测序法,分析青虾rDNA基因内转录间隔区ITSl的DNA序列,以筛选青虾SNP位点。共分析了32个太湖水域野生青虾样本,结果表明,青虾ITSl序列平均长度为1749.8bp,是迄今已报道的最长的ITS1序列,A、G、T和C的平均含量分别为29.9%、28.3%、27.7%、14.0%,G+C的平均含量为42.3%。通过序列比对,共筛选出81个SNP位点,SNP位点出现频率为0.0463,其中36个为C/T转换(占44.44%),25个为A/G转换(占30.86%),5个为A/T颠换(占6.17%),8个为T/G颠换(占9.88%),5个为A/C颠换(占6.17%),1个为C/G颠换(占1.23%),1个A/T或C颠换(占1.23%)。青虾ITS1序列的81个SNP位点中,80个位点为2个等位基因,1个位点出现了3个等位基因,为复等位基因位点;有22个SNP位点,其最少出现的等位基因在群体中的基因频率等于或大于0.0625(即≥2/32)。此外,青虾ITS1序列中还发现3个具有多态性的微卫星位点、1个高度变异区以及大量的缺失、插入。本文首次对青虾ITS1序列进行了分析,初步弄清了其序列特征,积累了青虾遗传背景知识,在此基础上,发现了大量的SNP位点,填补了青虾SNP研究的空白,为青虾遗传育种研究提供了新的分子标记。 在筛选出青虾SNP分子标记的基础上,本文应用ITS1序列中的SNP位点对太湖青虾、“选育青虾”及其杂种进行了遗传分析。本文共分析了27个个体,其中太湖青虾、选育青虾及杂种各9个个体。结果表明,杂种ITSl序列长度介于双亲之间,并且接近双亲的中间值;A、G、T和C的含量及G+C含量等平均值,三个群体没有显著差异。通过全部三个群体总计27个样本的ITS1序列比对,共发现86个SNP位点,SNP位点出现频率为0.0489,其中83个位点为2个等位基因,3个位点出现了3个等位基因,为复等位基因位点。全部86个SNP中,67个SNP位点仅在三个群体(太湖青虾、选育青虾和杂种)中的一个群体出现,即在对应位点仅一个群体出现碱基多态性,其它两个群体对应位点未出现碱基多态性;19个SNP位点在两个群体或三个群体中出现,即在对应位点多于一个群体出现碱基多态性,其中7个为C/T转换(占36.84%),4个为A/G转换(占21.05%),1个为A/T颠换(占5.26%),3个为T/G颠换(占15.79%),1个为A/C颠换(占5.26%),1个C/T或G颠换(占5.26%),1个A/G或C颠换(占5.26%),1个A/G或T颠换,(占5.26%),可用于杂交遗传分析;可用于杂交遗传分析的19个SNP位点中,有13个属于前期工作(第二章)筛选出的SNP,6个为新出现的SNP位点。青虾ITS1序列中还出现了2个具有多态性的微卫星位点、1个高度变异区以及大量的缺失、插入。SNP位点683bp(C/T)、1700bp(A/G)仅在母本太湖青虾和杂交虾中出现,说明杂交虾的这两个SNP位点来自母本;1190bp(T/G)、1673bp(C/T)、1765bp(T/G)3个SNP位点仅在父本选育青虾和杂交虾中出现,说明杂交虾的这3个SNP位点来自父本选育青虾;父母本共有但杂种中未出现的SNP位点有2个,分别是A/T1046、和A/G/T1768,推测可能是小群体的遗传漂变造成的;仅在杂种中出现的SNP位点有36个,父母本对应位点均没有出现碱基多态性,推测可能是父母本的遗传多样性造成。本文首次将SNP分子标记应用于青虾杂交遗传分析中,为青虾不同品系的种质鉴别奠定了基础。


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