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辣椒(Capsicum annuum L.)CMS基因的分子标记和相关基因的克隆与表达分析

刘科伟  
【摘要】:辣椒(Capsicum annuum L.)是世界性栽培的蔬菜作物,目前为我国第二大蔬菜作物。辣椒杂种优势显著,利用辣椒细胞质雄性不育系培育优良杂交品种具有很大的优越性。分子辅助育种能加速育种进程,本研究以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应保持系21B为材料,采用AFLP分子标记技术研究辣椒细胞质雄性不育系及其相应保持系基因组DNA的差异;应用实时荧光定量技术筛选辣椒中稳定的内参基因,采用同源序列克隆法克隆雄性不育相关基因,并研究该基因片段在辣椒不育系及其保持系中的表达差异。主要研究结果如下: 1.辣椒AFLP技术体系的建立与优化 以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料,通过对影响辣椒AFLP技术体系的若干关键因素,如提取DNA的方法、酶切与连接、预扩增和选择性扩增以及电泳和染色条件等的研究,建立了适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。采用该体系,对辣椒进行AFLP分析,能够得到清晰稳定的分子标记图谱,为今后利用AFLP技术进行辣椒细胞质雄性不育基因的定位奠定了技术基础。 2.辣椒细胞质雄性不育基因的AFLP分析 采用AFLP技术对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物Pst I-NNN+Mse I-NNN组合,有60对引物组合在两系间扩增出5447条带,多态性位点为4个,其中在不育系材料中仅有2个多态性片断AGC/CGC378和ATC/GAG446,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为340bp和408bp,它们的核苷酸序列与烟草基因组线粒体DNA序列同源性达94%和96%。 3.用实时荧光定量PCR技术选择辣椒内参基因 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术作为一种精确的基因表达分析技术已广泛应用于多种植物的研究中。qRT-PCR的精确定量需要稳定的内参基因,本研究对不同实验条件下辣椒的内参基因进行了评价。运用两个运算原理不同的软件geNorm和NormFinder,在不同的实验设置中对10个候选内参基因(Actin,Actin1,Actin2,18S rRNA,PPR1,GAPDH,TEFIA,EF1α,UEP和CYC)的表达稳定性进行评价。结果表明UEP,EF1α和Actin1是最稳定的内参基因组合,该研究对不同条件下辣椒内参基因的选择和基因表达分析具有重要的意义。 4.辣椒细胞质雄性不育相关基因的克隆与表达分析 根据辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应保持系21B的基因组DNA进行特异性扩增,获得了不育系特有的目的条带,克隆测序表明其大小为292bp,命名为CMS292,与orf456序列同源性达99%,编码97个氨基酸。运用荧光定量qRT-PCR技术对CMS292分别在蕾期、盛花期的根、茎、叶和花蕾中的表达水平进行分析,结果表明:该基因只在不育系中表达,并且在所检测的不育系各组织中均有表达;蕾期根和花蕾中的表达量明显高于茎和叶中的,盛花期根和叶中的表达量高于茎和花蕾中的;从蕾期到盛花期根、茎和花蕾中的表达量呈下降趋势,而叶中的表达量呈上升趋势,推测CMS292控制辣椒花药中蛋白的表达,引起小孢子败育,进而导致雄性不育。


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