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沉默Smad4对猪卵巢颗粒细胞增殖及细胞周期的影响

贺彧  
【摘要】:颗粒细胞是卵巢中十分重要的细胞,在其发育的不同阶段合成和分泌类固醇激素及多种生长因子,并通过自分泌/旁分泌途径发挥作用。颗粒细胞的生长发育,增殖分化对卵泡发育有重要影响。TGF-β/Smad信号通路是影响颗粒细胞生长发育的重要信号通路,Smad4是该信号通路的核心下游信号转导分子,是TGF-p超家族信号由胞质传递至胞核的必需因子。Smad4基因表达异常不但影响颗粒细胞自身生长发育,还会造成卵泡发育异常,甚至发生癌变,进而影响雌性动物的生殖机能。 本研究采用RNA干扰技术,设计并合成猪Smad4基因的靶向小分子干扰RNA,由LipofectamineTM RNAi Mix介导转染体外培养的猪卵巢颗粒细胞(Smad4-StealthTMRNA终浓度为13.3nM),沉默颗粒细胞的Smad4基因。应用荧光定量PCR法检测RNAi对颗粒细胞Smad4表达的抑制率,应用MTT法、流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期的变化,同时应用荧光定量PCR检测转染前后Cyclin D1、Cyclin B、Cyclin A2、Cdk1、Cdk2、Cdk4等周期相关基因的mRNA表达量的变化,以观察Smad4对颗粒细胞增殖和细胞周期的影响。研究结果如下: (1) RNAi可以有效抑制颗粒细胞Smad4基因表达。干扰36h后,Smad4基因mRNA表达量的抑制率为79.85%(P0.01)。 (2)RNAi沉默颗粒细胞Smad4表达可以明显抑制颗粒细胞增殖,干扰12h、24h、36h、48h和72h后,颗粒细胞的增殖存活率分别为空白对照组的90.6%、87.2%、84.8%、82.7%、80.9%,差异均存在统计学意义(P0.05)。 (3) RNAi沉默颗粒细胞Smad4基因表达可以阻滞细胞周期进程。流式细胞仪检测转染Smad4-StealthTM RNA36h后细胞周期变化,结果显示,G0/G1期细胞比例由平均86.84%(空白对照组)升高到92.82%(Smad4干扰组)(P0.05),S期细胞比例由平均6.13%(空白对照组)降低到1.64%(Smad4干扰组)(P0.05),G2/M期细胞比例变化不明显。用荧光定量PCR检测转染Smad4-StealthTM RNA对颗粒细胞Cyclin D1、Cyclin B、Cyclin A2、Cdk1、Cdk2、Cdk4等周期相关基因mRNA表达量的影响,发现转染36h后,以上几种基因的mRNA表达量分别降低到对照组的41.9%、77.3%、22.3%、64.3%、48.0%和61.1%。其中Cyclin D1、Cdk1、mRNA表达量显著低于对照组,Cdk2、Cdk4、Cyclin A2极显著低于对照组,Cyclin B差异不显著。 综上所述,Smad4是影响猪卵巢颗粒细胞增殖及细胞周期进程的重要基因。


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