水稻条斑病菌致病相关基因的鉴定与功能研究

【摘要】：水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下两致病变种之一,引起水稻细菌性条斑病(Bacterial Leaf Streak,简称条斑病,BLS)。近年来该病发生日趋严重,成为水稻上第四大病害。该病原菌从气孔或伤口侵入,在薄壁细胞间繁殖与危害,因受叶脉限制产生条斑病症状。由于感病杂交水稻大面积推广,且生产上无有效的抗条斑病种质资源,水稻安全生产受到严重的威胁。近年来,X. oryzae pv. oryzicola大量致病性相关基因(如hrp、avr、 rpf及其它毒性候选基因等)的研究揭示,毒性相关基因的鉴别是全面解析病原菌致病机理以及发展高效生物防治的基础。 目前,构建植物病原菌突变体库是挖掘新基因和进行功能基因组学研究的有效途径。因此,为了从全基因组范围内挖掘X. oryzae pv. oryzicola致病性相关因子,本研究以RS105为出发菌株,构建了一个包含25,000突变子的X. oryzae pv. oryzicola Tn5转座子插入突变体库,约5×ORF于基因组(约4,600个ORF)的覆盖量。Southern Blot分析表明,Tn5插入突变体库是稳定的、随机的。将每个突变子分别接种感病寄主水稻(cv. Shanyou63),经第一轮筛选共获得了1,753个致病性完全丧失或毒性减弱的突变体。为了进一步验证其在水稻上的致病表型,经第二轮筛选,共获得了114个致病性完全丧失或毒性显著减弱的突变体,其中致病性完全丧失的14个。随后,将114个致病性完全丧失或毒性显著减弱的突变体分别接种非寄主烟草(cv. Xanthi),共获得23个过敏性反应(hypersensitive response, HR)丧失或明显减弱的突变体,其中HR完全丧失的15个。以上突变体的获得,为分析X. oryzae pv. oryzicola致病性相关基因提供了材料基础。 为了快速准确地确定Tn5插入的位点和具体功能基因,本研究采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术对114个致病性完全丧失或显著减弱的突变体进行了鉴别。结果显示,转座子Tn5插入在致病性相关基因上,包括hrp、avr、rpf、wxoc、代谢相关基因、conserved hypothetical protein及其它毒性基因等。大批致病相关基因的发现,不仅为从分子水平上解析X. oryzae pv. oryzicola的致病机理,而且对于揭示植物-病原物互作的致病性和抗病性,具有全局性的科学价值。 关键毒性基因的功能鉴定是理解X. oryzae pv. oryzicola致病机理的先决条件。为此,对27个在水稻上完全丧失致病性或毒性显著减弱的突变体进行了分析。其中14个突变体完全丧失在水稻上的致病性和在烟草上激发过敏性反应(hypersensitive response, HR)的能力(表型为Pth-/HR-);另外13个突变体全毒性显著减弱,但仍具有在烟草上激发HR的能力(Vir-/HR+)。Tn5插入基因序列分析揭示,14个Pth-/HR-突变体是Tn5插入在以下基因上：hrcC(2个)、hrcT、hrcV(4个)、hpaP、hrcQ、(2个)/hrpF、hrpG和hrpX(2个)；13个Vir-/HR+突变体被Tn5插入的基因分别是：tal-C10c-like(TAL效应分子)、rpfC(致病性调控子)、oxyP(过氧化压力调控子)、dsbC(二硫化合物异构酶)、opgH(葡聚糖生物合成葡(萄)糖基转移酶H)、rfbA(1-磷酸葡萄糖乙酰基转移酶)、amtR(氨基转移酶)、purF(氨基磷酸核糖转移酶)、thrC(苏氨酸合成酶)、trpA(色氨酸合成酶a亚基)和3个功能未知蛋白的基因Xoryp_02235、Xoryp_00885和Xoryp_2910。即这27个突变体是Tn5插入在21个不同的ORFs上。此外上述13个全毒性减弱的突变体,功能互补都能恢复至野生型水平,这表明amtR、purF、thrC、trpA、Xoryp_02235、Xoryp_00885和Xoryp_22910是参与X. oryzae pv. oryzicola全毒性的新基因,未见在其它植物病原细菌中报道。Real-time PCR证明,上述7个新毒性基因在植物中是受诱导表达的,但是它们在参与X. oryzae pv. oryzicola致病机理上的详细功能,仍需进一步的研究。 植物病原细菌与寄主互作的一个重要方面是病原菌在植物组织内获取营养的能力。碳水化合物的获取对于病原菌在寄主植物中生长繁殖、成功建立营养寄生关系至关重要。尽管代谢途径一般不认为是毒性因子,但是阐述碳水化合物获取与代谢的详细机制对于全面理解X. oryzae pv. oryzicola的寄生性和致病性具有重要科学意义。 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FbaB),是有机生物体糖酵解和糖异生途径中的一个重要代谢酶。X. oryzae pv. oryzicola基因组中唯一的fbaB基因突变,不仅导致病原菌丧失利用丙酮酸和苹果酸进行生长的能力,也延缓其利用果糖作为唯一碳源时的生长；而且也降低了胞外多糖(EPS)的产量及降低了细菌在水稻上毒性和生长。经序列分析发现fbaB启动子区含有一个不完全的PIP-box (Plant-inducible promoter, TTCGT-N9-TTCGT)。有意义的是,fbaB的表达受hrp调控子HrpG和HrpX的负调控,且PIP-box碱基置换改变了它们对fbaB的调控。Real-time PCR结果显示,RS105菌株中的fbaB在植物中是受诱导表达的；而且fbaB缺失抑制了hrpG和hrpX的表达,hrcC、hrpE和hpa3的转录反而增强,对其余的hrp-hrc-hpa基因表达没有影响。而碳源利用能力测定揭示,hrcC、hrpE和hpa3突变体相应减弱了病原菌利用丙酮酸和苹果酸的能力。另外,fbaB突变体在植物上的毒性和生长以及EPS的产量,功能互补能够完全恢复至野生型水平。这是第一次报道表明,X. oryzae pv. oryzicola吸收的碳水化合物在fbaB基因位点通过一个未知因子在调节hrp基因的表达上扮演着重要作用。 另外,对X. oryzae pv. oryzicola全基因组搜索发现了两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,催化6-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖酸,在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径(ED途径)与磷酸戊糖途径中发挥着重要作用。为了明确这两个基因的功能,本研究对X. oryzae pv. oryzicola中起主导作用的zwf(Xoryp_12765)基因进行了缺失突变。结果显示,zwf突变后,病原菌利用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖的能力显著降低,但不影响其利用丙酮酸或苹果酸的能力。这表明,zwf突变可能阻碍了磷酸戊糖途径和ED途径,但不影响糖异生途径。同时也发现zwf是受诱导表达的,相对于无糖条件下的,葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖及半乳糖均显著增强zwf的转录水平达3倍以上。有趣的是,zwf突变导致DSF信号通路关键基因如rpfF、rpfG、clp基因的转录表达发生改变,这暗示,zwf可能参与对DSF下游某些毒性因子的调控。此外,zwf突变,X. oryzae pv. oryzicola胞外蛋白水解酶活性增强,胞外多糖的产量降低、游动性及水稻上的毒性减弱。经功能互补能够完全恢复至野生型水平。这些结果说明,zwf是X. oryzae pv. oryzicola全毒性所需的。 6-磷酸葡萄糖异构酶在碳水化合物代谢中具有重要作用,可逆的催化6-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸果糖。Xoryp_10540(pgi)是X. oryzae pv. oryzicola全基因组中6-磷酸葡糖异构酶唯一编码基因。实验表明,pgi突变致使病原菌不能有效利用果糖、蔗糖、甘露糖、丙酮酸,但是不影响其在葡萄糖或半乳糖作为唯一碳源的培养基上生长。值得一提的是,pgi突变导致DSF信号通路关键基因rpfF、rpfG、clp基因的转录表达发生显著改变。DSF信号检测显示,pgi突变体产生的DSF信号较野生型RS105水平明显减弱。这些结果提示,pgi突变可能对DSF信号调控网络下游基因的表达有一定的影响。同样地,pgi突变降低了病原菌的胞外多糖(EPS)的产量、游动性,并减弱病原菌在水稻上的毒性。功能互补能够完全恢复至野生型水平。这些结果说明,pgi是X. oryzae pv. oryzicola EPS产生和全毒性所需的。 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下另一致病变种,通过T3SS将各类效应蛋白注入寄主植物细胞内,引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB),是水稻上三大病害之一。病原菌通过叶尖和叶缘上的水孔侵入水稻叶片,定殖于维管束中并在木质部进行传播。依据本实验室基因芯片数据,筛选获得一个参与X. oryzae pv. oryzae能量代谢的基因,PXO03531(ketoglutarate transport protein, kgtP)。该基因在hrpX或hrpG突变体中的表达显著下调。分析发现,kgtP启动子区存在一个不完全的PIP-box (TTCGA-N21-TTCGC),且其编码产物KgtP的N端前50个氨基酸具有典型的Ⅲ型分泌信号。这提示,X. oryzae pv. oryzae kgtP可能是HrpX的调节子及T3SS效应分子。RT-PCR实验证实,HrpX和HrpG正调控kgtP的表达。免疫杂交结果显示,KgtP依赖T3SS,但不依赖于T3S出口控制蛋白HpaB进行分泌。细胞定位结果显示KgtP定位在细胞膜上,推测其结合到植物细胞膜上从而有利于从植物体内获取α-酮戊二酸。kgtP缺失突变,减弱了病原菌在植物上的生长与毒性,且细菌不能在含有α-酮戊二酸或琥珀酸钠为唯一碳源的基本培养基上生长,功能互补能有效恢复至野生型水平。RT-PCR结果显示,X. oryzae pv. oryzae在加入α-酮戊二酸为唯一碳源的基本培养基或与水稻悬浮细胞互作,kgtP的表达受到显著诱导,表明kgtP是受诱导表达的。有趣的是,kgtP缺失突变可以导致水稻上合成α-酮戊二酸的异柠檬酸脱氢酶基因表达明显下降。据此推测,在腐生状态下,X. oryzae pv. oryzae借助KgtP把体外的α-酮戊二酸转运至细胞内；当与水稻细胞互作时,则在HrpX调控下进行表达,通过T3SS进行分泌,结合在寄主细胞膜上,并把寄主细胞内的α-酮戊二酸转运至细菌细胞内以获得营养。