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富硒益生菌对猪细胞免疫的调节作用及其机理研究

任飞  
【摘要】:硒是人和动物必需的微量元素之一,具有调节机体代谢、提高机体免疫力和抗病力、影响人和动物的生殖机能、抗肿瘤、抗自由基、延缓衰老和拮抗有毒元素等多种重要的生物学功能,所以日粮补硒现已是许多国家养殖业采取的常规措施。硒在体内以硒代半胱胺酸的形式掺入到各种硒蛋白中,通过后者发挥其生物学功能。益生菌具有维持肠道菌群平衡、防治胃肠道疾病,产生多种酶类、合成多种营养物质、促进生长,增强机体免疫机能等生物学功能,目前广泛作为饲料添加剂应用。当前广泛使用的补硒方法是添加无机硒——亚硒酸钠,但由于亚硒酸钠利用率低、毒性大,其本身具有过氧化作用,而且对环境会造成潜在的污染,因此一些国家已经限制使用亚硒酸钠作为硒的营养补充剂。富硒益生菌是本实验室研制的饲料添加剂产品,能同时发挥有机硒和益生菌的双重生物学功能,已获国家发明专利。前人的研究表明,有机硒(如富硒益生菌,主要含硒蛋氨酸)的毒性小、生物利用率高。本文研究了日粮添加富硒益生菌对仔猪生产性能、免疫功能、硒的吸收转化、抗氧化能力和淋巴细胞中主要硒酶mRNA表达的影响,并在细胞和分子水平上探讨其主要的有机硒成分(硒蛋氨酸,Se-Met)对细胞免疫的作用机理,为富硒益生菌在生猪养殖生产上的广泛应用提供理论依据。 试验1.猪GPx1、GPx4及TR1mRNA表达水平Real-time PCR检测方法的建立 根据已公布猪的β-actin、GPx1、GPx4和TR1基因的mRNA序列,应用生物软件辅助设计并合成4对特异性引物;以Oligo dT为引物,对从猪脾脏中抽提的总RNA进行反转录,合成第一链cDNA;以cDNA为模板,分别进行4个目的基因片段的PCR扩增;胶回收PCR产物,将其克隆到pMD18-T载体上并测序;对抽提的重组质粒进行拷贝数测定,以10倍梯度稀释的质粒作为标准模板进行PCR扩增,同时对荧光定量PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化。结果,4对引物分别扩增出一条目的带,且大小与预期相符合;荧光定量PCR反应的最佳引物浓度是10μmo/L加入0.4μl,最佳退火温度为60℃;各荧光定量PCR产物熔解曲线均显示单一峰,表明产物单一;各目的基因的标准曲线的R2均达到0.99以上,符合要求。结果表明,本试验成功地建立了检测猪GPx1、GPx4和TR1mRNA水平的荧光定量PCR方法。 试验2.日粮添加富硒益生菌对仔猪生长性能和免疫功能的影响 48头健康断奶仔猪(杜×长×大),随机均分为对照组、益生菌组、富硒酵母组、亚硒酸钠组和富硒益生菌组。对照组(C)饲喂基础日粮;益生菌组(P)日粮中添加益生菌;其余2组日粮中分别添加富硒益生菌(SP)和亚硒酸钠(SS),其剂量以硒计均为0.3mg/kg饲料。整个试验期为42d。在试验0d和42d分别测定生产性能相关指标;于试验的第0、14、28和42d,采集血液样品,用于分析血清猪瘟抗体水平、IL-2和TNF-α浓度。在试验的第42d,每组随机选择3头仔猪,采集血样和脾脏,用于分析T淋巴细胞转化情况。结果,日粮中添加P、SS和SP均可显著改善饲料的报酬率,提高仔猪的平均末重、平均日增重和料重比(P0.05);在添饲后的第42d,P组、SP组和SS组的血清猪瘟抗体水平均显著高于对照组(P0.05);在添饲后的第42d,P组、SS组和SP组仔猪外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞的T细胞增殖能力显著高于对照组(P0.05),并且SP组仔猪的淋巴细胞T细胞增殖能力显著高于其他各组(P0.05);在第42d,SP组和SS组和P组的IL-2和TNF-α浓度均显著高于对照组(P0.05),并且SP组仔猪的细胞因子水平有高于其他各组的趋势(P0.05);以上结果表明,富硒益生菌能提高仔猪的生产性能和提高仔猪的免疫功能,并且其提高仔猪细胞免疫的效果优于亚硒酸钠。 试验3.日粮添加富硒益生菌对仔猪硒沉积和抗氧化能力的影响 试验设计同试验2。于试验的第0、14、28和42d,采集血液样品,用于分析血硒含量、红细胞GPx1活性、血浆GPx3活性和血浆MDA含量。于试验的第42d,每组随机选择3头仔猪,采集各组织样品,用于分析组织硒含量。结果,日粮中添加SP组的仔猪全血Se含量显著高于SS组(P0.05),并且两组均显著高于对照组(P0.05),而P组与对照组的全血硒含量差异均不显著(P0.05)。在第42d,SP组和SS组的肝脏、肾脏、肌肉和脾脏硒含量均显著高于对照组和P组(P0.05),并且SP组与其他各组相比均差异显著(P0.05),而P组与对照组的肝脏、肾脏、肌肉和脾脏硒含量差异均不显著(P0.05);在日粮中添加SP和SS组可以显著提高仔猪红细胞GPx1活性(P0.05),且SP组的最高,而P组与对照组的红细胞GPx1活性差异均不显著(P0.05);在整个试验期间,SP组和SS组的血浆GPx3活性均显著高于对照组和P组(P0.05);在第14、28和42d,SP组和SS组的血浆MDA含量均显著低于对照组和P组(P0.05),且SP组的血浆MDA含量均显著低于SS组(P0.05)。以上结果表明,与亚硒酸钠相比,富硒益生菌在提高仔猪血硒和组织硒含量、机体抗氧化能力和降低血浆MDA含量方面更为优越。 试验4.日粮添加富硒益生菌对仔猪外周血淋巴细胞主要硒酶mRNA表达的影响 试验设计同试验2。于试验的第0、14、28和42d,采集血液样品,用于分析外周血淋巴细胞中GPx1、GPx4和TR1mRNA水平。结果,在第14、28和42d,与对照组比,SS和SP组的仔猪外周血淋巴细胞GPx1和TR1mRNA水平均显著升高(P0.05),且SP组仔猪外周血GPxl mRNA水平显著高于其他组(P0.05),而所有硒处理组的淋巴细胞GPx4mRNA水平无显著变化;以上结果表明,硒对不同的硒蛋白的调控并不相同,日粮中硒水平的改变对淋巴细胞GPx1mRNA的表达影响最大,对TR1mRNA的表达影响次之,而对于GPx4mRNA的表达几乎没有影响。而且富硒益生菌促进淋巴细胞GPx1mRNA表达的效果更好。 试验5.硒对不同丝裂源介导的猪脾脏淋巴细胞T细胞活化的影响 来自健康仔猪的原代脾脏淋巴细胞用0(对照)、0.5、1、2和4μmo/L的亚硒酸钠(Na2SeO3)(?)育,并使用不同丝裂源刺激培养48h。结果,硒显著的促进了刀豆蛋白A (ConA)和T细胞受体(TCR)介导的T淋巴细胞增殖和IL-2的产生,但是对植物血凝素(PHA)介导的T淋巴细胞活化没有影响,使用流式细胞术测定T细胞的增殖情况,进一步证实了这一结果;在不受刺激、TCR、ConA或PHA刺激的淋巴细胞中,添加硒的各组GPx1mRNA和TR1mRNA水平、细胞内还原型GSH浓度和GPx活性均显著提高(P0.05)。这些结果表明硒改善了不同丝裂源刺激的淋巴细胞的氧化还原状态,但是只有TCR和ConA介导的淋巴细胞活化受到了影响。而作为一种单纯的抗氧化剂,NAC显著的促进了TCR或ConA介导的淋巴细胞活化,但是对PHA刺激淋巴细胞没有影响,进一步证明了PHA介导的淋巴细胞增殖对于氧化还原状态的改变并不敏感。以上结果表明,硒对不同丝裂源介导的淋巴细胞活化的调控是有差异的;而导致这一差异的主要原因是因为TCR、ConA以及PHA介导的淋巴细胞对于氧化还原状态存在不同的敏感性。 试验6.不同形式和浓度的硒对原代脾脏淋巴细胞T细胞增殖的调控 来自健康仔猪的的原代脾脏淋巴细胞用使用5μg/ml的ConA刺激,并同时加入0(对照)和各种浓度的(以硒计)硒蛋氨酸(Se-Met)或亚硒酸钠(Na2SeO3)孵育培养48h。结果,0.5-32μmol/L的Se-Met处理组的ConA介导的T细胞增殖显著高于对照组(P0.05),而Na2SeO3处理组的淋巴细胞增殖在2μmol/L时达到最大值,之后随着浓度的增大而降低,呈剂量依赖模式,并且在8μmol/L及更高浓度会抑制T淋巴细胞的增殖;添加0.5-4μmol/L的Se-Met或Na2SeO3的细胞内还原型GSH浓度均显著高于对照组(P0.05),但是Na2SeO3添加浓度大于2μmol/L时,会使得GSH浓度与最高值相比下降。添加Se-Met或Na2SeO3的细胞内GPx1mRNA水平均显著升高(P0.05),而两种形式的硒处理细胞的GPx4mRNA水平无显著变化(P0.05);添力口0.5-4μmol/L的Se-Met或Na2SeO3可以显著提高细胞内GPxl活性(P0.05),而且4μmol/L的Se-Met处理组的GPx1活性水平在所有Se处理组中最高(P0.05;添加GPx1的抑制剂巯基琥珀酸(MS)可以使硒促进淋巴细胞增殖的作用消失,并且显著抑制淋巴细胞的增殖。综上所述,不同形式和浓度的硒对ConA介导的原代培养猪脾脏淋巴细胞增殖的调控是有差异的,GPx1可能是其中的关键酶。


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