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四种有机磷农药核酸适体的筛选、鉴定及其活性研究

王丽  
【摘要】:有机磷农药是我国广泛使用的杀虫剂,国家标准规定农产品中有机磷农药的最大允许残留量为0.2mg/kg,但近年来由于不合理的使用已严重的危害到我国的食品安全,因此发展快速的农药残留检测技术尤为重要。核酸适体(Aptamer)作为一种具有替代抗体潜能的新型仿生生物识别元素,是近年来研究的热点。在食品安全领域,已有抗生素、重金属、食源性致病菌、生物毒素等多种物质的核酸适体被成功筛选和应用,但目前关于有机磷农药核酸适体的筛选和应用还鲜见报道。本研究利用SELEX技术对甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果四种有机磷农药的DNA适体进行了筛选,并对筛选获得的适体的亲和活性、特异性及活性位点进行了研究,主要研究内容及结果如下: 1.适体SELEX筛选中单链DNA的制备 探讨了在适体SELEX筛选中,利用凝胶捕获法制备单链DNA(ssDNA)的试验条件,为适体SELEX筛选中次级库的生成奠定基础。将PCR扩增后带生物素和荧光标记的dsDNA连接在链霉亲和素标记的凝胶上,用NaOH变性解链制备ssDNAo结果表明:dsDNA与凝胶结合的时间40min为佳;NaOH的浓度0.1mol/L较适宜。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明优化试验条件下制备的产物为ssDNA。这种制备ssDNA的方法操作简单、方便、所需时间短,制备的ssDNA带有荧光标记,便于用荧光法监控适体的筛选过程,对于适体SELEX筛选中次级库的生成是很好的选择。 2.四种有机磷农药DNA适体的筛选 利用SELEX技术从一个固定的随机ssDNA库中同时筛选甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果四种有机磷农药的DNA适体。随着筛选轮数的增加,四种有机磷农药从固定的随机库中洗脱的ssDNA逐渐富集,经过12的轮筛选,筛选效率达到40.8%;对第12轮洗脱的ssDNA进行克隆、测序,挑选的15个阳性克隆均测序成功,由于部分克隆具有完全一致的序列,最终筛选到5条ssDNA序列;一级结构序列分析表明5条ssDNA具有一定的同源性,二级结构预测表明5条ssDNA的二级结构主要以茎环结构为主,茎环结构可能是适体结合四种有机磷农药的基础。 3.适体活性鉴定方法的建立 建立了基于结构转换信号和分子信标的两种鉴定适体活性的荧光检测策略,优化了荧光检测条件,并比较了两种方法的检测效果。基于结构转换信号的适体活性鉴定方法的影响因素试验表明:试剂本底、游离态的猝灭序列Q-B、四种有机磷农药对反应体系荧光强度的影响较小,表明该荧光策略具有一定的可行性,荧光序列F-P1与猝灭序列Q-B的添加比例为1:2时,就能达到很好的荧光猝灭效果。基于分子信标的竞争抑制法的条件试验表明:设计的分子信标的发夹结构既能够成功闭合也能够成功被核酸适体打开,丙酮及四种有机磷农药对分子信标的发夹结构影响较小,分子信标性能稳定;适体与分子信标的添加比例为1:1.25,孵育时间为50min,孵育温度为室温,农药靶分子在分子信标之前加入能够取得较好的试验结果。两种方法对混合适体的活性鉴定效果表明:基于结构转换信号的方法荧光强度变化较小,荧光回复率较低,不能很好的对适体活性做出判断;基于分子信标的竞争抑制法检测效果明显,更适用于适体的活性鉴定。 4.适体的活性、特异性鉴定 利用建立的基于分子信标的竞争抑制法对筛选到的5条ssDNA进行了活性鉴定,5条ssDNA中SS2-55和SS4-54对四种有机磷农药表现出了较强的结合活性,水胺硫磷的抑制率高达75%以上,其它三种有机磷农药抑制率最低的也在39%以上。对于活性较高的SS2-55和SS4-54适体利用9种结构相似的农药进行了特异性分析,结果表明两条适体对九种农药的结合活性很低,抑制率都在15%以下。利用荧光结合超滤的方法对其平衡解离常数(Kb)进行了测定,结果表明SS2-55和SS4-54适体对四种有机磷农药的平衡解离常数在0.83~2.5μmol/L之间。这些结果说明SS2-55和SS4-54适体对四种有机磷农药的亲和活性、特异性较高,可能是结合四种有机磷农药的广谱型适体。 5.适体活性位点的研究与分析 利用适体剪切和拼接的手段对SS2-55和SS4-54适体进行了结构改造,并利用基于分子信标的竞争抑制法对改造的适体的活性进行了鉴定,根据结构改造前后适体活性的变化探索了适体结合四种有机磷农药的活性位点;并利用紫外光谱法研究了四种有机磷农药和四种碱基的相互作用,结合适体结构改造的结果,进一步分析了适体Loop环上的结合位点。基于适体剪切的活性位点分析表明:对于SS2-55适体,Loop2-4是四种有机磷农药共有的活性位点,尤其对于氧化乐果至关重要;Loop2-3是识别甲拌磷的重要活性位点;Loop2-1、Loop2-2是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位点。对于SS4-54适体5’端和3’端残余的核苷酸对甲拌磷和氧化乐果是重要的活性位点,Loop4-2、Loop4-1是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位点;Loop4-3是丙溴磷和氧化乐果共有的活性位点。基于适体片段拼接的适体活性位点分析表明:适体与农药靶分子的结合并不是简单的活性部位的堆积,有的活性部位可能不是结合部位,但它却对维持适体的活性有一定作用;几个碱基的不同就可能引起适体活性很大的变化。紫外吸收光谱研究结果表明:四种有机磷农药对四种碱基的紫外吸收光谱都有一定程度的影响,使四种碱基的吸收峰发生了红移和减色效应;四种有机磷农药中,水胺硫磷与胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤的相互作用最强,氧化乐果与鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶的相互作用其次,而甲拌磷、丙溴磷与碱基之间的相互作用较弱。Loop环上的T、C碱基是水胺硫磷重要的结合位点,A、G碱基是氧化乐果重要的结合位点,G碱基是丙溴磷重要的结合位点,而Loop环上的碱基不是甲拌磷直接作用的位点。


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