水稻细菌性条斑病菌中六个假定外泌蛋白的鉴定与致病功能研究

【摘要】：水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc)和水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae,简称Xoo)两个致病变种。其中,Xoc从水稻的气孔侵入,引起细菌性条斑病；Xoo从水稻的水孔侵入,引起白叶枯病。一直以来,细菌性条斑病和白叶枯病严重危害我国的水稻种植。目前,对Xoc致病机理的研究主要集中在群体感应受体蛋白编码基因LuxR、无毒基因(如AvrXa7)、Ⅲ型分泌系统及其转运的效应因子、双组分调控系统、DSF型群体感应调控系统等基因和系统的功能分析,对于假定外泌蛋白的研究则少有报道。 通过生物信息学分析,我们从水稻条斑病菌的全基因组(X. oryzae pv. oryzicola strain BLS256)中找到了另外6个编码假定的外泌蛋白的基因(Xoryp010100004540, Xoryp_10100011980, Xoryp_10100015235, Xoryp010100018640, Xoryp010100020851和Xoryp_010100022495),有趣的是,这些蛋白缺席于水稻白叶枯细菌的全基因组当中,说明它们是一些新颖的对比于水稻白叶枯病菌是水稻条斑病菌中所独有的蛋白,并且它们在细菌致病性中扮演的角色还是未知的。 (一)采用PCR的方法从Rs105基因组中克隆到上述6个基因,通过插入突变的方法,分别构建了这6个基因的突变株。用针刺接种法对水稻叶片进行接种,结果表明：与野生型相比,突变体AXoryp_010100015235的致病性有显著性减弱。而对烟草叶片的致敏性则无明显改变。所以我们认为Xoryp_010100015235是最优的致病相关基因。 (二)从Rs105基因组中克隆到Xoryp_010100015235基因,并证实这个基因在基因组中为单拷贝。用同源重组法构建缺失突变体,测定突变体及其互补菌株的致病性和过敏性反应、菌体形态、游动性、胞外多糖与蛋白酶的产生能力、在水稻叶片中的繁殖能力以及生长能力等表型,研究显示Xoryp_10100015235这个基因突变后可造成致病性的明显减弱和胞外多糖(水稻条斑病菌重要的毒力因子之一)产量的显著性降低,我们命名Xoryp_10100015235为epv (extracellular polysaccharide and virulence related gene)。实时定量荧光PCR (qRT-PCR)显示基因gumB (编码胞外多糖生物合成最后一步的关键酶)和一个已报道的毒性相关基因pgk(编码磷酸甘油酸激酶)在epv的突变体中转录水平对比与野生型Rs105有显著性下调。此外,我们发现epv的转录水平在X. oryzae pv. oryzicola中受可扩散性信号分子(DSF)和全局调控因子Clp的正向调控。综上所述,首次报道epv这一新颖的致病相关基因,其在水稻细菌性条斑病菌中所扮演的角色是与胞外多糖产量和毒力密切相关。据我们所知,遗传学研究中关于epv在植物黄单胞菌属中有关其同系物的角色也无人报告。