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灰飞虱对氟虫腈的抗性机制研究

陈宇  
【摘要】:灰飞虱Laode1phax striatellus (Fall'en)属半翅目、飞虱科,主要分布于从菲律宾至西伯利亚一带的亚洲稻区和欧洲的温带地区。近年来,灰飞虱在江苏、浙江、上海、安徽及山东等地发生严重,造成病毒病流行,给水稻的稳产和高产带来严重影响。目前,化学防治仍然是控制灰飞虱的主要措施。为了控制害虫,新烟碱类和苯基吡唑类杀虫剂,例如:吡虫啉和氟虫腈,曾被广泛用于防治稻飞虱。由于频繁的使用氟虫腈,导致在东亚和东南亚地区已经出现了抗性问题。氟虫腈作为苯基吡唑类的第一个新型杀虫剂,目前对于它的作用机制尚不十分明确,因此,很有必要进行氟虫腈的靶标抗性机制、生化机制及其交互抗性研究。本研究结果可为科学合理使用同类药剂提供理论依据,同时可以丰富杀虫剂毒理学理论知识,为抗药性的治理提供理论依据。 本文在抗性筛选的基础上,进行了灰飞虱对氟虫腈的抗性靶标机制研究、生化机制及交互抗性研究,旨在明确灰飞虱对氟虫腈的抗性机制。 1.灰飞虱谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因的克隆与序列分析 采用简并引物和半巢式PCR技术从灰飞虱中克隆谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)受体基因,获得了1个长度为431bp的目标基因中间片段,根据这个中间片段设计特异引物进行RACE扩增,成功地获得了灰飞虱GluCl亚基的全长基因序列。其基因GenBank登录号为:JF430868。该基因cDNA全长为2112bp,开放阅读框(ORF)为1359bp,ORF编码452个氨基酸残基。其蛋白质分子量为52.12560KDa,预测的等电点为8.3。GluCl与已报道的其他昆虫的GluCl基因氨基酸序列比对,一致性为79%-86%。 2.灰飞虱谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因的多态性研究与突变位点预测 为了寻找灰飞虱对氟虫腈产生抗性的靶标基因的突变位点,本研究利用巢式PCR技术分别从原始品系和抗性品系中克隆了20头和10头灰飞虱成虫的单个个体的谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因的开放阅读框序列,对所获得的目的基因序列进行比对分析。结果显示,共有75个位点的碱基变化造成了氨基酸的替换。在这75个氨基酸替换中,9个(L13P、 D63A、 P65H、A66T、V67I、 V74L、 S76P、 V83T、T84K)分别为抗性和敏感品系的部分个体所具有,31个(T7A、 I19T、N23D、 T33H、 P104S、 P128L、 E132G、H136R、 I149V、 L176P、 D194V、 P197S、E201G、 G201R、 V205E、 C237R、 L242E、 Y250H、 V263M、 S275G、 P278S、 M291T、 N299D、 L302P、 Y309R、 E328G、 Q344R、 E353G、 N373S、 K389R、 K394R)仅发生在部分抗性品系中。剩下的35个(S27P、 Q43R、 G46D、 S48C、 I72L、 I77T、 K79T、D81S、 D82N、 V83I、 W97R、 L102P、 T146C、 I161V、 C167R、 D194G、 Y250C、 Y256C、 S282P、 V285A、 L288P、 S306P、 T315A、 M345V、 M345T、 Q351R、 C352Y、 V395A、 C406R、 T415P、 R417H、 I426T、P428Y、 L437P、 R446Q)仅发生在部分原始品系中。2个(V83T和V83I,M345V和M345T)在原始品系中的同一个氨基酸位置发生了不同的氨基酸替换。2个(D194V和D194G,Y250H和Y250C)在同一个氨基酸位置分别在抗性和原始品系中发生了不同的氨基酸替换。P278S存在于第二跨膜区,与之前已报道的其他物种的P299S是同一跨膜区的相似突变位点,而P299S是普遍存在于第二跨膜区的突变位点,因此,P278S氨基酸突变可能与氟虫腈的抗性有关。 3.灰飞虱GABA受体基因的克隆与突变位点分析 为了寻找灰飞虱对氟虫腈产生抗性的靶标基因的突变位点,本试验采用巢式PCR技术分别从抗性品系和原始品系中克隆了23个和20个单头灰飞虱成虫的GABA受体基因。并通过基因序列比对进行分析,结果显示,在原始品系和抗性品系中均没有发现保守的突变位点A302S,但是在同一位置,在原始品系中只有一种基因型(Ls-Ala),而在抗性品系中不仅有基因型(A1a),还有另一种基因型(Asn),即该位置的氨基酸由丙氨酸替换成了天冬酰胺氨基酸。而且该突变基因的频率在抗性种群中达到80%。本研究进一步证实了灰飞虱r-GABA受体基因的A2'N点突变位点可能与氟虫腈的抗性有关。除此之外,在含有A2'N突变的个体中同时存在R305Q或R305W点突变,该突变可能也与氟虫腈的抗性有关。 4.灰飞虱对氟虫腈的抗性生化机制研究 为了了解灰飞虱对氟虫腈产生高水平抗性是否代谢抗性有关,在室内测定了四种增效剂顺丁烯二酸二乙酯(DEM)、磷酸三苯酯(TPP)、氧化胡椒基丁醚(PBO)及脱叶磷(DEF)在原始和抗性品系中对氟虫腈的增效作用,结果表明:四种增效剂在原始品系(SR分别为0.77、0、89、0.91和0.93)和抗性品系(SR分别为1.27、1.18、1.18和1.00)中均没有增效作用。进一步对原始和抗性品系的三种解毒酶的离体活性测定发现:灰飞虱抗性品系的多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽-S-转移酶与原始品系的比活力分别为:0.90倍、0.99倍和0.99倍。结果表明多功能氧化酶、酯酶及谷胱甘肽-S-转移酶不是引起灰飞虱对氟虫腈产生高水平抗性的主要因素。 5.抗氟虫腈灰飞虱的交互抗性研究 本研究通过测定氟虫腈与狄氏剂和硫丹在抗性品系和原始品系中的交互抗性水平进一步验证了氟虫腈与环戊二烯类杀虫剂的抗性靶标是否完全一致。结果显示:由原始品系在室内经过连续77代筛选得到的抗性品系(86.6倍)与狄氏剂没有交互抗性(1.8倍),而与硫丹之间只有低水平的交互抗性(3.7倍)。表明氟虫腈与环戊二烯类杀虫剂可能有共同的作用靶标,但作用位点不一致或亲合性差异较大。


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