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甜叶菊同源四倍体种质创新及生物学特性比较

李红  
【摘要】:甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为菊科甜叶菊属多年生草本植物,其叶片中含有甜味成分(甜菊糖苷),甜度为蔗糖的250~300倍,该甜味成分无毒、高甜度、低热量、无副作用。作为一种新型的糖料作物,具有较高的经济价值。 本文以二倍体甜叶菊为试验材料,针对甜叶菊无菌快繁体系的建立;同源四倍体的离体诱导与鉴定;二、四倍体甜叶菊光合特性、生理指标、活性成分含量的测定;二、四倍体甜叶菊DNA的甲基化差异分析做了初步探讨,主要结果如下: 1.收集不同地区的甜叶菊,通过HPLC法测定其甜菊糖苷含量,筛选出甜菊糖苷含量高的材料并建立无菌快繁体系。本试验以健壮嫩芽为外植体建立了甜叶菊无菌快速繁殖体系。甜叶菊外植体最佳灭菌处理组合为75%乙醇消毒30s,0.1%HgCl2消毒4min,死亡率和污染率都较低。确立了MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L KT+0.2mg/LNAA复合培养基为甜叶菊不定芽增殖培养的最适培养基,其增殖不定芽倍数最高为6.9,且不定芽出芽快,整齐,生长健壮,色浓绿。1/2MS+0.10mg/L NAA+0.01mg/LIBA为甜叶菊最适宜的生根培养基,平均生根7.48条,生根率为100%,生根早,出根整齐,根长、粗壮,色淡白,健壮。甜叶菊组培苗最适炼苗时间为5天,移栽苗在第20天时成活率为90.77%。 2.在建立甜叶菊无菌快繁体系的基础上,利用0.05%、0.10%及0.20%的秋水仙素溶液浸泡甜叶菊的不定芽,来诱导甜叶菊同源四倍体,并通过染色体鉴定和流式细胞仪等途径鉴定其倍性。结果表明,0.20%的秋水仙素溶液处理甜叶菊不定芽12h,同源四倍体诱导率最高,可达32.14%。同源四倍体植株与二倍体(对照)相比,其植株表现出巨大性;叶片变厚、叶色浓绿、叶片皱缩;对照植株染色体2n=2x=22,四倍体植株染色体2n=4x=44;流式细胞仪倍性鉴定,对照DNA相对含量为100,四倍体DNA相对含量为200。 3.以甜叶菊二倍体及同源四倍体为试验材料,测定两种倍性植株叶片的光合特征:叶形指数、光合色素含量、光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)及生理生化指标:超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、甜菊糖苷含量。试验结果表明:四倍体的叶面积、叶厚、气孔长和宽、光合色素含量显著高于二倍体;四倍体的Pn、Gs、Ci、Tr远高于二倍体;四倍体的SOD、POD、CAT活性也明显高于二倍体,且MDA的含量显著低于二倍体;四倍体的甜菊糖苷含量比二倍体提高了4.45%,R-A苷含量提高了4.68%。 4.应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术研究不同倍性植株基因组之间的DNA甲基化水平及其模式变化。四倍体和二倍体甜叶菊甲基化敏感扩增多态性分别为46.10%、46.53%,与二倍体相比较,四倍体基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率均有所降低,而半甲基化率则有所升高;四倍体基因组DNA甲基化模式有29.72%(过甲基化为12.8%,去甲基化为11.81%,次甲基化为5.12%)发生了改变。


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