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萝卜抗坏血酸合成代谢相关基因克隆与表达特征分析

徐瑶  
【摘要】:萝卜、(Raphanus sativus L.)是一种重要的一、二年生蔬菜作物,深受人们喜爱。萝卜的食用部位是其肉质根,营养丰富,含有丰富的钾、碳水化合物、叶酸以及抗坏血酸等多种营养物质。抗坏血酸(AsA)是一种重要的抗氧化剂,并且在生物体内有着多种的生理生化作用。同时,AsA对根系生长发育也起着重要的作用。AsA不仅与根的不活动中心生长有关,也会影响侧根的生长,同时参与了根系的向性形成。然而根系中AsA相关研究相对匮乏,萝卜中抗坏血酸合成代谢相关基因表达特征研究尚未见报道。有鉴于此,本研究比较了萝卜中的AsA含量,并且分析了AsA合成及代谢途径中关键基因的表达模式,从转录水平上研究调控萝卜中AsA含量的关键基因,从而为阐明根菜作物AsA累积的分子机制提供了理论依据。主要结果如下: (1)根据拟南芥中的相关保守序列设计引物,利用同源克隆法,从萝卜中分离出4个抗坏血酸相关基因,分别命名为RsGMP、RsGME、RsGGP以及RsDHAR,并对其序列以及翻译的蛋白质进行分析。RsGMP的DNA全长2253bp.cDNA全长1416bp,其中包含1086bp的ORF,编码361个氨基酸;RsGME的DNA全长2013bp, cDNA全长1252bp,其中包含1140bp的ORF,编码379个氨基酸;RsGGP的DNA全长2256bp,cDNA全长1827bp,其中包含1305bp的ORF,编码434个氨基酸;RsDHAR的DNA全长1531bp,cDNA全长1033bp,其中包含774bp的ORF,编码257个氨基酸。以上结果为进一步研究萝卜累积的分子机制提供基础。 (2)分析了肉质根发育过程中根肉与根皮内AsA含量的变化,并且利用qRT-PCR技术研究了16个AsA相关基因的表达模式。结果发现在根皮与根肉中,AsA的含量均随着萝卜肉质根的生长发育而下降。根肉中,GMP、GME以及GalUR的表达量随着萝卜生长而下降,与AsA的含量变化,呈现相关性。于此不同的是,根皮中,GMP以及GalDH的表达量与抗坏血酸的含量变化,呈现相关性。同时L-半乳糖途径是萝卜AsA合成的主要途径,糖醛酸途径对萝卜中的AsA累积也起到一定的作用。以上数据推断出,GMP可能在萝卜肉质根AsA累积中起着重要的作用。 (3)比较了在光照处理下萝卜成熟叶、幼叶、根肉以及根皮4个部位中AsA含量的变化。同时,采用RT-PCR技术,分析了4个不同部位中AsA合成以及再生途径中的基因,在光照处理下其表达量的变化。最后利用qRT-PCR技术,分析萝卜成熟叶中AsA合成以及再生途径中的基因在光照处理下的表达模式。结果表明光照处理提高了成熟叶片中的AsA含量,而黑暗处理则导致AsA含量的降低,但是在幼叶、根皮以及根肉中没有这样的趋势;采用RT-PCR技术,检测出PMI、GMP、GGP以及GPP的表达量与光照呈现正相关:而利用qRT-PCR技术,检测出PMI、GMP、GGP、GPP、 MIOX以及GalUR的表达量与光照呈现正相关。


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