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桃microRNAs鉴定及内参基因的筛选

罗晓燕  
【摘要】:MicroRNA(miRNA)作为一类植物内源的、不编码蛋白的小分子RNA,在植物的生长发育、组织器官分化及抗逆境方面起了重要的调控作用。桃是蔷薇科研究的模式植物,也是世界重要的经济果树之一。桃miRNA及其靶基因在桃生长发育、果实调控等方面起重要作用。本文首先用生物信息学的方法预测桃基因组中的miRNA及其靶基因,并用RT-qPCR和RLM-RACE的方法对其中一部分预测的miRNA及其靶基因进行了验证;再通过高通量测序的方法鉴定出桃中保守的miRNA及桃中特有的miRNA,用降解组测序的方法寻找桃miRNA的靶基因;最后筛选出了桃在非生物逆境条件下,研究miRNA表达最适合的内参基因。主要结果如下: 1.利用桃基因组的数据和miRBase数据库,采用生物信息学方法对桃的miRNA及其靶基因进行了预测。根据miRNA在植物中的高保守性及miRNA前体的二级结构特征,筛选出了110个保守的miRNA及43个靶基因,这些miRNA属于37个miRNA家族。随后利用荧光定量PCR的方法对其中的25个miRNA进行了验证和组织差异表达,从荧光定量PCR的结果可以看出miRNA在不同的组织中的表达有差异。最后用RLM-RACE的方法对miRl56和miR172的靶基因进行了验证,结果发现它们的切割位点都位于miRNA和它靶基因配对区域的第十到第十一个碱基之间。 2.采用高通量测序的方法对桃的miRNA进行测序,不仅得到了属于46个miRNA家族的721个保守的miRNA,还预测到了341个新的候选miRNA。进一步利用荧光定量PCR的方法对其中30个保守的miRNA及15个新的miRNA进行了验证和组织差异表达分析。 3.以桃的茎、叶、花为材料,构建了三个降解组文库,利用已测得的miRNA进行分析,最后得到了655个保守miRNA的靶基因和85个新候选miRNA的靶基因。 4.以桃的‘早凤王’品种为材料,对其幼苗进行三种非生物逆境胁迫处理,用两个常用的内参基因5.8s rRNA、U6和桃的15个miRNA作为候选内参,利用荧光定量PCR的方法对这17候选内参的稳定性进行检测。经过稳定性分析软件GeNorm和NormFinder综合分析后,我们发现桃在非生物逆境条件下,研究miRNA表达最适合的内参基因是miR5059和miR5072。


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