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小鼠卵巢氧化应激模型建立以及卵巢保护性抗氧化剂的筛选

张家庆  
【摘要】:随着生活节奏的日益加快,社会竞争的日益激烈,无论是学习还是工作都处于紧张状态,过度的紧张和焦虑导致现代职业女性的心理压力越来越大,生殖系统疾病的发病率越来越多,卵巢氧化应激引起的人类生殖疾病也日益升高。卵巢氧化应激不仅影响着卵子的生成、卵泡的发育、卵子的成熟、卵泡的闭锁和排卵等,还能降低卵母细胞和胚胎的质量以及影响早期胚胎的发育能力,这些都会使受精率、胚胎质量、妊娠率显著降低。由于伦理和道德等原因,很难在人类对卵巢氧化应激的发生、发展和治疗进行深入细致的研究。因此建立成功可靠的动物卵巢氧化应激模型,用于揭示卵巢氧化应激机制以及开发研究新型抗卵巢氧化应激药物具有重要的实际意义。本研究应用氧化剂3-NPA成功建立了小鼠卵巢氧化应激模型,并对此模型进行了评估。利用建立的小鼠卵巢氧化应激模型,研究比较了10种不同抗氧化剂对卵巢氧化应激的保护作用,共筛选出了4种效果显著的卵巢保护性抗氧化剂,这对于研究卵巢氧化应激机制以及研究抗卵巢氧化应激药物的作用机制有着重要意义。1、利用3-NPA建立小鼠卵巢氧化应激模型的研究 本试验通过观察ICR雌性小鼠体内注射不同浓度氧化剂3-NPA(6.25,12.5和25mg/kg)后,卵巢组织中ROS水平,抗氧化酶活性、各级卵泡数量、排卵数及早期胚胎发育等指标来判断卵巢氧化损伤的情况。结果表明,与对照组相比较,小鼠腹腔内注射3-NPA (12.5mg/kg)连续7天,不仅能显著提高小鼠大卵泡闭锁比例,降低卵巢重量和大卵泡数量(P0.05),还能显著降低小鼠排卵数量和早期胚胎发育能力(P0.05)。除上述指标外,3-NPA (12.5mg/kg)还能显著降低颗粒细胞中Bcl-2/Bax的比值,提高(SOD2、CAT、GPX) mRNA的表达和ROS的水平(P0.05)。结果表明,小鼠腹腔内注射3-NPA(12.5mg/kg)连续7天,可诱导卵巢颗粒细胞凋亡,大卵泡闭锁和提高卵巢中ROS的水平。3-NPA所诱导的小鼠卵巢氧化应激的损伤可作为卵巢氧化应激的动物模型。 2、卵巢氧化应激保护性抗氧化剂的筛选 本研究通过使用所建立的小鼠卵巢氧化应激模型,研究比较了不同抗氧化剂对体内卵巢氧化应激的抗氧化保护作用。通过对10种不同抗氧化剂:VC、VE、胡萝卜素、谷胱甘肽、没食子酸、姜黄素、原花青素、白藜芦醇、L-半胱氨酸和辅酶Q,抗氧化活性的检测,我们将组织中的ROS水平和抗氧化物酶(SOD、CAT、GPX)的活性作为抗氧化功能的测定指标。结果表明,L-半胱氨酸、没食子酸、姜黄素、原花青素、白藜芦醇和胡萝卜素6种抗氧化剂能够显著降低卵巢组织内ROS的水平(P0.05);其中姜黄素、原花青素、白藜芦醇和胡萝卜素4种抗氧化剂可显著提高卵巢的重量(P0.05)、GSH、VE、L-半胱氨酸、没食子酸、VC、辅酶Q、白藜芦醇、胡萝卜素8种抗氧化剂均可使卵巢组织中代偿升高的GPX活性显著下降(P0.05)。GSH、VE、L-半胱氨酸、姜黄素、VC、辅酶Q、白藜芦醇、胡萝卜素8种抗氧化剂均可使卵巢组织中代偿升高的T-SOD明显降低(P0.05)。GSH、VE、原花青素、辅酶Q、胡萝卜素5种抗氧化剂均能够降低卵巢中代偿升高的CAT活性(P0.05)。本研究表明,卵巢氧化应激能够导致卵巢组织的过氧化损伤,从而促进卵巢相关疾病的发生,体内补充抗氧化剂能够显著降低卵巢过氧化损伤和提高卵巢组织的抗氧化功能。3、不同抗氧化剂体外抗氧化活性的比较研究 本研究以体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞为研究对象,观察不同抗氧化剂:原花青素(PC)、维生素C(VC)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)对3-NPA致小鼠卵泡颗粒细胞损伤的保护作用。本研究共分为5组:阴性对照组、3-NPA模型组、PC组(50μg、100μg,200μg/mL).VC组(25μg、50μg、100μg/mL)和NAC组(25μg、50μg、100μg/mL)。采用体外培养的方法,建立3-NPA致小鼠颗粒细胞氧化损伤模型。观察各组细胞的形态和结构;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率,化学比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性;TUNEL法检测细胞凋亡率,RT-PCR法分析了抗应激基因和凋亡相关基因的表达情况。结果表明,高浓度的PC、VC、NAC均可减轻3-NPA诱导的颗粒细胞氧化损伤,与3-NPA组相比较,PC、VC、NAC组细胞存活率由53.7%分别上升到85.3%、63.8%和60.5%(P0.05);细胞凋亡率由38.2%分别降低到13.4%、23.6%和25.8%(P0.05);PC、VC、NAC组细胞内SOD活性明显降低(P0.05),PC和VC组细胞内MDA含量显著降低(P0.05);PC、VC、NAC组细胞内抗应激和凋亡相关基因的表达水平明显降低(P0.05)。结论:PC和VC对3-NPA诱导的卵泡颗粒细胞的氧化损伤有显著的保护作用,其机制可能与提高颗粒细胞的抗氧化能力以及降低凋亡率有关。4、小鼠卵巢氧化应激对繁殖性能的影响 为了研究卵巢氧化应激对孕鼠胚胎发育的影响,本研究利用以建立的小鼠卵巢氧化应激模型为研究对象,在超数排卵处理后,雌雄小鼠合笼,于次日早晨检查阴道栓。孕鼠分别在孕龄7.5d、12.5d和18d颈椎脱臼处死,处死前分别称重,然后剖腹取出子宫,分离出子宫内胚胎,分别称重,计数胚胎数量。结果表明,和对照组(生理盐水)相比较,3-NPA诱导的卵巢氧化应激组显著地降低了孕鼠体重和增重;提高了胚胎的死亡率;降低了胎仔数量和胎鼠重量。结论:小鼠卵巢氧化应激能够显著地降低受孕率和繁殖性能。 本研究利用氧化剂3-NPA成功地建立了小鼠卵巢氧化应激模型,并且具有卵巢氧化应激的典型特征,如颗粒细胞凋亡,卵泡闭锁和卵巢中ROS的升高等,均能在此模型中显著地观察到。通过比较不同抗氧剂对卵巢氧化应激的保护作用,发现多酚类抗氧化剂具有较强的抗氧化活性,对卵巢氧化损伤具有很好的保护作用。


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