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猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用

尹梅  
【摘要】:猪瘟(classical swine fever, CSF)是猪的一种高度接触性烈性传染病,被认为是严重危害和制约我国养猪业发展的重要传染病。尽管我国早在1956年就研制出了世界上最有效的猪瘟兔化弱毒疫苗,成功控制了猪瘟在我国的大规模爆发,但其一直没有得到根除。近年来,猪瘟在我国的流行呈现非典型性、慢性、持续性感染和隐性感染等新特点,免疫猪群发生猪瘟的情况越来越多,这些对猪瘟的预防和控制提出了新的挑战。 我国现阶段主要采用ELISA方法对免疫猪群进行抗体水平的监测,该方法需要几小时才能完成,且要求有熟练的实验操作人员和特殊的仪器,不能满足临床实践中对抗体水平监测,快速、可靠、廉价的需求。因此,建立猪瘟病毒抗体的快速检测方法具有非常重要的意义。现有研究表明,猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白能刺激动物机体产生中和抗体,是CSFV最重要的保护性抗原,可用于建立猪瘟血清学检测方法。 本研究利用原核表达的猪瘟E2融合蛋白,建立了检测猪瘟病毒抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析方法,制备了快速检测试纸条,取得了如下研究结果: 根据GenBank上发表的猪瘟病毒E2蛋白的基因序列,设计引物扩增去除信号肽和跨膜区的大小约560bp的E2基因片段。将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a (+)中,成功构建高效表达载体pET-32a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析初步确定融合蛋白在上清中表达,大小约为38KDa。E2蛋白经镍柱纯化后进行Western blotting分析,表明融合蛋白E2-pET32a具有免疫原性。用纯化的E2蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗E2蛋白多克隆抗体,抗血清经粗提和纯化,抗体蛋白的浓度为2.1mg/ml. 采用柠檬酸三钠还原法,制备的胶体金颗粒的直径为20-30nm,质量良好。选用猪瘟重组E2蛋白标记胶体金作为捕捉抗原,将纯化的E2蛋白和兔抗E2多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)的检测线和质控线上,制备猪瘟抗体胶体金免疫层析检测试纸条。经试验证实,胶体金标记蛋白的最适pH值为7.5,E2蛋白最适标记量为9.6mg/ml;最佳的蛋白包被液为0.01mol/LpH7.2的PB+0.1%BSA; E2蛋白的最佳包被浓度为1.5mg/ml;兔抗E2IgG最佳包被浓度为1.0mg/ml;最佳封闭液配方为:0.5%PVP+0.75%吐温-20+0.5%PEG20000+2%BSA+0.02%NaN3+10mM pH7.2PBS.对试纸条进行了特异性检测,结果显示试纸条特异性良好,不与BVDV, PRRSV和PCV2抗体发生交叉反应。并且稀释CSFV标准抗体到1:16时仍可以检测到条带,说明试纸条灵敏度尚可。 应用制备的CSFV抗体检测试纸条和IDEXX的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒,分别检测来自江苏太湖和浦口的共计80份血清样品,两种检测方法的符合率为90.3%。


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