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樟巢螟性信息素组分的鉴定及气味结合蛋白基因的克隆和功能分析

刘世晶  
【摘要】:香樟树是重要的园林景观树木,因其四季常绿、枝叶清香等优点,被广泛种植。樟巢螟(Orthaga achatina Butler)是樟树重要害虫,随着樟树种植范围的扩大,樟巢螟的发生和为害也日趋严重。樟巢螟幼虫的结苞危害习性,导致传统的化学防治的效果并不理想,加之景观树种上害虫无公害防治的特殊要求,需要开发并应用更为高效的环境友好防治技术。昆虫性信息素技术已在很多害虫,特别是蛾类害虫的防治中得到应用,有望应用于樟巢螟的无公害防治中,但相关研究尚属空白。本实验室从2009年起开展樟巢螟性信息素鉴定及其应用技术研究,系统观察了樟巢螟成虫的交配行为以及触角上感器的类型及分布,并初步鉴定了一个性信息素组分。在此基础上,本文进一步鉴定了樟巢螟的其余性信息素组分,并据此配制性信息素诱芯进行了田间诱蛾试验;同时,为了探讨樟巢螟的嗅觉机制,并为高效嗅觉干扰剂的开发提供潜在的靶标基因,本文还对樟巢螟的2个气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)基因进行了克隆和功能分析。主要结果如下: 1樟巢螟雌蛾性信息素组分的鉴定 运用气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)从樟巢螟雌蛾性信息素腺体中鉴定出3个组分:Z11-16:Ac、E11-16:OH和Z9-16:OH。利用二甲基二硫醚(DMDS)甲硫基化反应和GC-MS进行了双键定位分析,证实了Z11-16:Ac和El1-16:OH的双键位置,而Z9-16:0H由于含量较其双键位置低没有得到证实,待进一步验证。 2樟巢螟对气味物质EAG及行为反应测定 利用触角电位(EAG)技术,测定了樟巢螟对3种性信息素组分和20种植物挥发物的电生理反应。结果表明,3种性信息素组分均能引起樟巢螟雄虫触角明显的EAG,其中以Z11-16:Ac引起的反应明显较大;樟巢螟触角对20种植物挥发物均有反应,且大小趋势在雌雄间基本一致,反应较强的有顺-3-己烯醇丁酸酯、芳樟醇、己醇、醋酸己酯、樟脑5种植物挥发物。根据信息素鉴定及EAG测定结果,配制诱芯进行田间诱捕实验表明,3、6、7、N7号4种诱芯均显示一定的诱蛾活性;两种诱捕器比较发现,水盆诱捕器效果较好,干式诱捕器没有效果。 3樟巢螟气味结合蛋白基因的克隆及表达谱分析 根据已发表的昆虫信息素结合蛋白(Pheromone binding protein, PBP)和普通气味结合蛋白(General odorant binding protein, GOBP)基因序列设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术从樟巢螟雄虫触角中分别克隆到1个PBP和1个OBP基因,分别命名为OachPBPl和OachGOBP2.进一步利用实时定量PCR技术分析2个基因在樟巢螟不同组织及雌雄触角间的表达差异,发现OachPBP1和OachGOBP2都只在雌雄触角中表达; OachPBP1在雄虫触角中的表达量明显高于雌虫触角,前者是后者的3.9倍,但OachGOBP2在雌雄触角间无显著差异。 4樟巢螟PBP1和GOBP2的原核表达及配体结合能力 将两个OBP基因构建到pET-30a(+)表达载体中,在大肠杆菌中经IPTG诱导后得到成功表达,然后利用镍离子亲和层析法和肠激酶酶解得到纯化的蛋白。在此基础上,采用荧光竞争结合实验测定了2种OBP对樟巢螟性信息素组分及其类似物以及植物挥发物的结合能力。结果表明,OachPBP1对13种性信息素组分及其类似物均有很强的结合能力,说明OachPBP1可能参与了性信息素组分的识别和运输;OachGOBP2除与一些植物挥发物结合外,与3种性信息素组分也有很高的结合能力(与OachPBP1类似),推测OachGOBP2不但参与植物挥发物而且还可能参与性信息组分的嗅觉过程;此外,法呢醇和法呢烯与OachPBP1和OachGOBP2均具有较强的结合能力,暗示这两种物质或其类似物在樟巢螟的嗅觉行为中起作用。


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