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小梅山猪BMSC的分离培养及其增殖和分化的研究

樊懿萱  
【摘要】:骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)是一群存在于骨髓中、具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞,在一定条件下,可分化为多种细胞,且免疫原性低,在组织工程中有着广泛的应用前景。BMSC的增殖和分化潜能是其应用于干细胞治疗的关键。但是,随着传代次数的增加,BMSC的增殖分化潜能逐渐降低。随着BMSC各项临床研究的深入开展,为了满足研究需要,需要在体外大量扩增功能完善的BMSC。Oct4和Sox2是维持胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)多能性和自我更新必需的转录因子。资料表明,Oct4在小鼠ES细胞和生殖系干细胞表达。过表达Oct4导致ES细胞分化成内胚层和中胚层,而敲除Oct4使ES细胞失去多能性,分化为滋养外胚层。Sox2在胚胎癌细胞、囊胚的内细胞团、外胚层和生殖细胞中表达。与Oct4一样,Sox2对于胚胎发育和阻止ES细胞的分化都是必需的。而且,诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)研究的4个核心转录因子包括Oct4和Sox2。由此可见,Oct4和Sox2在细胞重编程及维持细胞的干细胞特性中起关键作用。鉴于此,本研究开展了以下三个试验,通过分离培养小小梅山猪BMSC,较为系统全面地研究其增殖和诱导分化能力,以及过表达Oct4或Sox2基因对小小梅山猪BMSC的增殖和分化潜能的影响,为其临床应用奠定理论基础。本试验的结果如下:1.采用全骨髓法分离培养小小梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期;细胞压片进行染色体分析;通过免疫荧光染色、流式细胞术和RT-PCR法检测细胞表面标志及转录因子的表达情况。结果显示,小小梅山猪BMSC体外培养生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定,具有分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志呈阳性,CD45呈阴性;BMSC表达Fou5F1、Sox2和Nanog等多能转录因子,而不表达Lin28。总之,采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的小小梅山猪BMSC,生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞。2.采用以计数法和多向诱导分化等方法比较第3代(P3)和第12代(P12)小小梅山猪BMSC在细胞形态、增殖及多向分化潜能方面的差异。结果表明,传代培养的细胞,开始时大多为细长梭形,增殖速度快,细胞传代周期较短,待传至第7、8代时细胞铺展得宽大而扁薄,增殖速度减慢,细胞传代周期延长。多向分化潜能比较结果显示,BMSC成脂诱导21 d后,油红O染色发现P3细胞较P12细胞诱导后分泌的脂滴增多;荧光定量PCR检测P3细胞脂肪特异性转录因子PPARγ和CEBPα的mRNA表达水平,发现两者表达水平均显著高于P12细胞(P0.05)。成骨诱导2周后,P3细胞碱性磷酸酶染色阳性的矿化结节多于P12细胞;荧光定量PCR检测P3细胞成骨分化基因表达发现,Osteocalcin,Osteonectin和Type Ial等成骨细胞特异性基因的mRNA表达水平显著高于P12细胞(P0.05)。由此可见,低代次小小梅山猪BMSC表现出更强的增殖和分化潜能,为今后充分利用这种丰富的干细胞资源作为细胞学研究扣细胞治疗的基础研究提供理论依据。3.以小梅山猪BMSC为模型,采用计数法、成纤维细胞集落(CFU-F)和多向诱导分化等方法研究过表达Oct4或Sox2对BMSC增殖和分化的影响。结果发现,与对照组相比,过表达Oct4或Sox2的BMSC的增殖和克隆形成率较高。多向分化潜能比较结果表明,BMSC成脂诱导21d后,油红O染色发现过表达Oct4或Sox2的BMSC比对照组细胞诱导后分泌的脂滴多,荧光定量PCR检测过表达Oct4或Sox2的BMSC脂肪特异性转录因子PPARγ和CEBPα的mRNA表达水平,发现其均显著高于对照组(P0.05)。成骨诱导2周后,过表达Oct4或Sox2的BMSC茜素红染色阳性的矿化结节多于对照组;荧光定量PCR检测过表达Oct4或Sox2的BMSC成骨分化基因Osteocalcin,Osteonectin和Type Ial的mRNA表达水平显著高于对照组(P0.05)。由此可见,过表达Oct4或Sox2基因能提高小梅山猪BMSC的克隆形成率、增殖和分化潜能,为其应用于临床实践奠定理论基础。


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