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解淀粉芽孢杆菌SQR9吲哚乙酸合成途径及促生效应的研究

邵佳慧  
【摘要】:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueliciens)SQR9是本实验室从黄瓜根际分离的一株促生菌株,对黄瓜专化型病原菌尖孢镰刀菌有很强的拮抗功能。在盆栽和大田试验中,该菌株表现出良好的促生和土传病害防控效果,其与腐熟堆肥制成的微生物有机肥在农业生产中已得到广泛应用。本文通过盆栽实验验证了解淀粉芽孢杆菌SQR9对植株生长的促进作用,检测了SQR9产生的各种促生因子,通过转录水平分析、基因敲除、基因融合表达和随机突变建库的方法探索了SQR9吲哚乙酸(IAA)合成的机制,并研究了IAA对SQR9促生能力的影响,获得了以下研究结果:1. 在黄瓜及玉米盆钵实验中,解淀粉芽孢杆菌SQR9能显著促进两种植物的生长。1×109 CFU SQR9活体菌处理(T2)比5×108CFU活体菌的处理(T1)促生效果更好,而两个灭活菌体的处理无显著差异。与对照相比,T1和T2处理的地上部分干重、黄瓜株高、根长和根表面比例分别升高60.1%、45.7%、29.3%和30.7%以及90.0%、71.6%、56.3%和65.6%。在玉米处理中,T1处理的玉米株高、地上部分干重、根长和根表面积升高比例分别为36.2%、30.6%、32.1%和20.0%以及T2处理相对应的指标升高65.3%、47.8%、42.6%和52.0%。2. 以哥伦比亚型拟南芥为材料与SQR9和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α共培养16 d后,对其长势进行观察。与PBS对照和E.coli DH5α处理相比,SQR9处理的拟南芥生长旺盛,根长和叶片大小均高于前两者,以此可以初步推断,SQR9可以产生挥发性物质(VOC)促进拟南芥的生长。3. 通过化学分析的方法表明,SQR9在实验室条件下可产生植酸酶、2,3-丁二醇、乙偶姻、IAA和赤霉素(GA3),且在培养基中加入色氨酸后IAA产量明显升高。4. 根据植物和微生物中已报道的IAA合成途径,通过预测SQR9基因组(NCBI登录号:CP006890)中基因的蛋白功能域,筛选出SQR9中14个可能与IAA合成相关的候选基因。为检测筛选出的基因是否参加色氨酸依赖型IAA合成途径,我们对加入色氨酸培养的细胞中这些基因表达情况进行转录水平分析。结果发现6个基因转录水平明显上调,包括:patB,编码一个可能的转氨酶,上调3.5倍;咖cX,预测的腈水解酶,上调3倍;dhaS,编码一个可能的吲哚乙醛脱氢酶,上调了2.5倍;ysnE,预测为IAA乙酰转移酶基因,上调了2倍;yclB,预测蛋白为芳香酸脱羧酶,上调了1.5倍;yclC基因和yclB基因位于同一个基因簇,编码芳香酸脱羧酶,上调了2倍。我们推测这六个基因可能参与SQR9中IAA合成的IPyA途径、TAM途径、IAN途径和一个未确认的合成途径。5. 采用双交换重组的方法对筛选出的六个基因进行敲除。发现突变菌株AysnE、ΔdhaS.AyclC和ΔyhcX IAA产量分别为野生型SQR9菌株的14%、23%、45%和76%,而突变体ΔpatB和Δyc1B IAA产量和SQR9相比没有明显变化。采用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pUBC-19对突变体ΔysnE、ΔdhaS、Δyc1C ΔyhcX和ysnE进行互补实验,结果表明各突变体的互补菌株IAA合成恢复到和SQR9相当的水平。由结果可知,(patB.yclC编码的色氨酸酰基转移酶可能参与SQR9中IAA合成的主要途径,IPyA和TAM途径也颇为重要,而IAN途径对SQR9中IAA的合成贡献较小6. 根据上述反转录定量PCR及突变子分析的结果,我们挑选出三个可能组成IPyA途径的基因dhaS)和pUBC19-P43并通过同源和异源表达加以验证。通过融合PCR将这三个基因连接起来,再插入到构建好的pUBC19-P43质粒中,使其在P43启动子的调控下表达。为测定同源与异源表达菌株产IAA的能力,使用含空载(SQR9-E)IAA质粒的枯草芽孢杆菌168和SQR9作为对照。SQR9过表达菌株SQR9-CK的产量是mariner的4倍,约为42 mg l-1,枯草芽孢杆菌过表达菌株(168-E)与对照相比IAA产量升高10倍,约为22 mg l-。7. 利用Himarl·转座元件SQR9-IAA1转座诱变体系构建解淀粉芽孢杆菌SQR9菌株的突变体文库。在3000个转化子中筛选得到三株IAA产量稳定变化的突变株,在SQR9-IAA2突变株的发酵液中检测到IAA含量很低,SQR9-IAA3突变株发酵液中的IAA为野生型SQR9的50%,而SQR9-IAA1突变株的IAA产量明显升高,约为野生型SQR9的2.4倍。通过转座子插入位点分析可知,在qoxB菌株中,转座子插入位点为qox基因簇的SQR9-IAA2基因;在ylmD菌株中,转座子插入到SQR9-IAA3基因;突变体yngF。插入位点为107CFU ml-1这三个基因在SQR9中参与IAA合成的机理还需要进一步的研究。8. 为研究IAA产量变化对SQR9促生效果的影响,我们采用IAA合成变化的突变菌株研究其对黄瓜和玉米生长及对黄瓜根系发育的影响。野生型SQR9在菌液浓度为CFU ml-1时,对黄瓜根的伸长具有最显著的促进效果,菌液浓度在108CFUml-1时,对黄瓜初生根的伸长具有抑制效果,却刺激次生根的形成。在菌液浓度为107ΔysnE时,与对照相比,SQR9处理的根长增长了137%,根表面积增长了88%。IAA产量下降的菌株CFU ml-1对黄瓜的根长和根表面积均没有显著促进效果。IAA产量升高的过表达菌株SQR9-E处理过的黄瓜与对照相比根长增长了58%,但与SQR9处理相比降低了32%,与对照相比根表面积增长了166%,与SQR9处理的黄瓜相比根表面积仅下降了15%。盆栽实验中,与对照相比,各处理均表现出对黄瓜和玉米生长的促进作用。突变菌株SQR9-IAA1对黄瓜和玉米的促生能力与野生型SQR9相比略有降低,其中黄瓜植株的生物量和株高降低了约24%和19%,玉米植株的生物量和株高降低了约21%和17%。与SQR9处理相比,AysnE处理黄瓜两个指标分别下降了23%和15%,玉米的两个指标分别下降15%和16%。IAA产量下降50%的菌株SQR9-IAA2促生能力与野生型菌株相似。IAA产量升高的菌株SQR9-IAA3和SQR9-E对黄瓜和玉米的生长促进效果比野生型SQR9菌株更为明显,在黄瓜中SQR9-IAA3处理的植株的生物量和株高升高了约40%和19%,SQR9-E处理的两个指标分别升高41%和18%;在玉米中SQR9-IAA3处理的植株的生物量和株高升高了约21%和29%,SQR9-E处理的两个指标分别升高18%和31%。


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