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枯草芽胞杆菌Bs916产罗克霉素、表面活性素、杆菌霉素和泛革素的结构鉴定、合成途径及生物学功能

罗楚平  
【摘要】:枯草芽胞杆菌是一种重要的生防微生物,能在环境中很好的定殖和能分泌丰富的次生抗菌代谢物质,已成功的应用于多种植物病害的防治。枯草芽胞杆菌分泌的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草素(iturin)和泛革素(fengycin)对植物病原真菌、细菌和卵菌都具有重要的抗菌活性;在植物病害的生物防治中具有潜在的用途而被广泛深入研究。为进一步阐明商品化枯草芽胞杆菌Bs916在防治植物病害的生化分子机理,本论文在Bs916全基因组框架测序的基础上,通过生物信息学分析发现Bs916含有9个次生抗菌代谢产物基因簇,初步推测其具有潜在分泌近十种次生抗菌代谢产物的能力。让我们最感兴趣的是Bs916基因组中含有四种潜在合成脂肽类抗生素的基因簇,除了三种已知的分别负责表面活性素合成的基因簇srf,杆菌霉素L合成的基因簇bmy,泛革素合成的基因簇fen,还含有一个低同源性的新型罗克霉素的基因簇loc。对Bs916发酵液中脂肽类抗生素进行初步提取,生物活性实验表明初提物具有广谱的抗真菌活性和细菌活性。采用高效液相色谱质谱联用技术检测到初提物中除了表面活性素、杆菌霉素L和泛革素的质谱峰外,还检测到分子质量相差一个亚甲基的3个质谱峰,推测属于新型脂肽类抗生素的质谱峰。对枯草芽胞杆菌Bs916基因组中低同源性的非核糖体合成途径(NRPS)的基因簇(loc)的生物信息学分析表明loc基因簇含有四个开放阅读框,分别编码四个复合酶locA、locB、locC和locD,含有六个腺苷酰化结构域(A domain)ψ通过同源重组破坏罗克霉素中关键基因和重组表达腺苷酰化结构域的结果证明loc基因簇负责罗克霉素的生物合成。采用高效液相色谱联用质谱的方法检测罗克霉素的分子质量,发现罗克霉素的分子质量也包括相差一个亚甲基的3个质谱峰,与Bs916发酵液中检测到的3个新型质谱峰完全一致。进一步通过酸沉淀、有机溶剂抽提、固相萃取和制备性高效液相色谱得到罗克霉素3个同系物的纯品。采用氨基酸分析、多级质谱和核磁共振等技术阐明了罗克霉素的化学结构。罗克霉素是由含有9个氨基酸残基的多肽链与含有13~15个碳原子的脂肪酸链通过酰胺键相连形成的环脂肽类抗生素。将罗克霉素和已知的脂肽类抗生素进行比较,发现罗克霉素属于一类新型的脂肽类抗生素家簇。对罗克霉素的生物活性测定表明,罗克霉素对多种病原细菌和病毒都具有较高的抑制活性,尤其是罗克霉素具有较低的溶血活性表明其在农业、工业和医药等领域具有潜在的应用价值。另外,根据罗克霉素的化学结构和loc基因簇的特征,本论文还提出了一条罗克霉素生物合成代谢途径,该非核糖体合成途径包含以下几个非典型的特征:1)非线性的合成机制,如结构域忽略,重复使用和选择性变化等;2)催化环肽的N-酰基帽修饰;3)环化9个氨基酸残基的特异硫酯酶结构域。环脂肽抗生素罗克霉素结构的解析和合成基因簇的鉴定,为进一步详细探明含有六个模块的非糖体基因簇催化含有九个氨基酸残基的环脂肽类化合物的非线性合成机理奠定了基础。最近的研究表明脂肽类抗生素还能调节枯草芽胞杆菌典型生物学性状:抗菌活性、溶血活性、游动性、生物膜和菌落形态等来影响枯草芽胞杆菌的生物防治效果。通过基因组分析和质谱分析发现枯草芽胞杆菌Bs916中含有四种脂肽类抗生素表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素的基因簇。为进一步研究这四种脂肽类抗生素基因簇对枯草芽胞杆菌生物学性状的影响,本论文通过同源重组构建了八个单基因、双基因或三基因敲除突变株,它们分别丧失一种、两种或三种脂肽类抗生素的合成。通过对这些突变株的生物学性状研究表明杆菌霉素L和泛革素基因簇的突变显著降低了Bs916的抗真菌活性;表面活性素基因簇的突变株抗真菌活性也显著降低,推测可能是表面活性素合成基因簇的突变影响了杆菌霉素L和泛革素的合成;除了泛革素基因簇突变株之外,其他三种脂类抗生素基因簇的突变都显著影响Bs916的菌落形态;尽管罗克霉素和泛革素基因簇的突变对Bs916的溶血活性、游动性和生物膜形成影响甚微,但表面活性素和杆菌霉素L基因簇的突变对Bs916的溶血活性、游动性和生物膜形成影响显著。总而言之,表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素基因簇对Bs916典型性状的影响是各具特点、贡献不一和协同增效。表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素具有广谱的抗菌活性和溶血活性,在生物技术和生物制药领域都具有广泛的应用前景。然而,除了表面活性素有商品化生产外,其它三种抗生素目前都没有商品化纯品生产。本论文报道了从枯草芽胞杆菌916突变株的发酵液中快速分离纯化这四种脂肽类抗生素的提取方法,并对制备的纯品进行了生物活性分析。通过选择适当的突变株发酵,采用酸沉淀,有机溶剂抽提和固相萃取的方法我们制备了表面活性素、杆菌霉素L、泛革素和罗克霉素纯品。生物活性分析的实验结果表明表面活性素和杆菌霉素L具有较强的溶血活性,泛革素和罗克霉素的溶血活性较弱;杆菌霉素L和泛革素具有较强的抗真菌活性,而表面活性素和罗克霉素具有较强的抗细菌和病毒的活性;表面活性素和杆菌霉素L能部分恢复相应突变株游动性和生物膜的形成能力。这四种脂肽类抗生素纯品的制备为以后进一步深入研究其生物学功能奠定了基础。生防枯草芽胞杆菌Bs916对水稻纹枯病具有很好的防治效果。尽管枯草芽胞杆菌916产生的脂肽类抗生素的抗菌活性被阐明,但是关于脂肽类抗生素影响枯草芽胞杆菌916在环境中定殖能力的报道甚少。枯草芽胞杆菌Bs916,水稻叶鞘和水稻纹枯病菌的相互作用为研究枯草芽胞杆菌在植物叶面的定殖能力提供一个很好的研究模型。在构建表面活性素突变株△srf、杆菌霉素L突变株△bmy和双突变株△srf+bmy的基础上,本论文采用绿色荧光蛋白标记的手段研究了野生型枯草芽胞杆菌Bs916和其突变株在水稻叶鞘的定殖能力。研究结果表明野生型枯草芽胞杆菌Bs916能很好的在水稻叶鞘的病斑部位形成生物膜,具有良好的定殖能力;然而突变株不能在水稻叶鞘病斑部位形成生物膜,基本丧失了定殖能力。进一步通过盆栽防效实验表明野生型枯草芽胞杆菌Bs916对水稻纹枯病菌具有较好的防治效果,而三个突变株对水稻纹枯病的防治效果都显著下降。简而言之,表面活性素和杆菌霉素L是通过各自的作用机理,以协同的作用方式影响枯草芽胞杆菌Bs916的抗真菌活性、生物膜形成和田间定殖能力,从而影响其生物防治效果。


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